何玲玲，韋國(guó)兵，胡奇軍

（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

·論著·

高效液相色譜法測(cè)定銀黃口服液中黃芩苷含量及不確定度分析

何玲玲，韋國(guó)兵，胡奇軍

（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

目的建立銀黃口服液中黃芩苷的定量測(cè)定方法，并對(duì)所建立方法進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)。方法采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定銀黃口服液中黃芩苷含量，再根據(jù)方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，對(duì)測(cè)定過(guò)程中引入的不確定度進(jìn)行評(píng)估，由此計(jì)算合成不確定度，最終給出測(cè)量結(jié)果在95%置信區(qū)間下的擴(kuò)展不確定度。結(jié)果采用本方法測(cè)定銀黃口服液中黃芩苷的擴(kuò)展不確定度為2.40%。結(jié)論建立的黃芩苷HPLC定量測(cè)定方法，結(jié)果準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好；建立的不確定度評(píng)定適用于HPLC法測(cè)定藥物中有效成分的不確定度分析。

銀黃口服液；黃芩苷；HPLC；不確定度

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之間的分散性與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)系的參數(shù)，是被測(cè)量客觀值在某一量值范圍內(nèi)的一個(gè)評(píng)定，其大小決定了測(cè)量結(jié)果的實(shí)用價(jià)值[1]。不確定度越小，測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量越高，實(shí)用價(jià)值越大?！稒z測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》規(guī)定，檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室都必須有對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定的程序，以對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果的可信度進(jìn)行評(píng)定。目前，測(cè)量不確定度的理論已在國(guó)家計(jì)量基準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究及儀器校準(zhǔn)、化工生產(chǎn)和產(chǎn)品檢驗(yàn)等領(lǐng)域得到大力的推廣應(yīng)用，因此正確表達(dá)和評(píng)定測(cè)量方法的測(cè)量不確定度正逐步成為國(guó)際通行的要求[2]。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)很多學(xué)者對(duì)銀黃口服液中的黃芩苷開展了含量測(cè)定[3-5]，但很少對(duì)其開展不確定度分析。本文根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[6]（JJF1059-1999）中有關(guān)規(guī)定對(duì)高效液相色譜法測(cè)定銀黃口服液中黃芩苷含量的不確定度進(jìn)行分析，找出影響其不確定度的因素并對(duì)各分量進(jìn)行評(píng)估，最終給出測(cè)量結(jié)果的置信區(qū)間和置信水平，以期加強(qiáng)對(duì)含量測(cè)定的數(shù)據(jù)分析和測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），G1314B紫外檢測(cè)器，GZX-9070 MBE恒溫箱，色譜柱Kromasil 100-5C18ODS2（5μm，250 mm×4.6 mm，瑞典Kromasil公司），AB104-N電子天平（瑞士METTER公司）；KQ-100型超聲波清洗機(jī)（江蘇昆山超聲儀器有限公司）。

金銀花、黃芩藥材均購(gòu)自江西省樟樹市藥材市場(chǎng)，黃芩苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物檢定所（質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，批號(hào)：110715-201016），甲醇為色譜純，其他為分析純；水為雙蒸餾水。

1.2 銀黃口服液制備

取黃芩和金銀花，參照《中國(guó)藥典，2010版》（一部）[7]進(jìn)行提取，分別得黃芩提取物和金銀花提取物；將黃芩提取物加水適量使之溶解，用8%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0，過(guò)濾，濾液與金銀花提取物合并，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到7.2，煮沸1 h，過(guò)濾，加入單糖漿適量，加水至全量，搖勻，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到7.2，加水至1 000 ml，濾過(guò)，滅菌即得銀黃口服液樣品。

1.3 色譜條件

色譜柱Kromasil 100-5C18ODS2（5μm，250 mm× 4.6 mm）。流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（45.0∶55.0∶0.2）。檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：室溫；流速：1 ml/min；理論塔板數(shù)按黃芩苷的色譜峰計(jì)算不少于2 200。

1.4 溶液制備

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥的黃芩苷對(duì)照品6.8 mg于25 ml的容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20 min，搖勻，定容至刻度，即得到濃度為0.272 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備精密吸取銀黃口服液2.0 ml置于25 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲30 min，搖勻過(guò)濾，定容至刻度，即得供試品溶液。

1.4.3 陰性樣品溶液的制備取金銀花按照《中國(guó)藥典》（2010版，一部）[7]制備工藝制備成相應(yīng)的陰性樣品溶液。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 線性關(guān)系考察精密吸取0.272 mg/ml的黃芩苷對(duì)照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0和4.0 ml分別置于10.0 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得到0.00544、0.01088、0.0272、0.0544、0.0816及0.1088 mg/ml的對(duì)照品溶液。分別取以上6種對(duì)照品溶液各進(jìn)樣10μl，記錄色譜圖色譜峰面積，以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)作線性回歸，回歸方程為：Y=5835.5x-79.640，r=0.9992，表明黃芩苷進(jìn)樣量在0.0000544 mg～0.001088 mg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.5.2 精密度試驗(yàn)取濃度為0.272 mg/ml的對(duì)照品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得黃芩苷峰面積的RSD為0.91%。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取配制好的同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12和24 h進(jìn)樣各10μl，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD值，RSD為1.2%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，可以用于樣品的重復(fù)測(cè)定。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)銀黃口服液樣品（批號(hào)：140608）6份，精密吸取，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得黃芩苷含量為0.09449 mg/ml，RSD為1.3%。1.5.5回收率試驗(yàn)取同一批號(hào)銀黃口服液樣品（批號(hào)：140710）6份，再分別用移液管精密移取1 ml溶液于3只10 ml容量瓶中，進(jìn)行編號(hào)。再分別用移液管量取對(duì)照品溶液（0.272 mg/ml）相當(dāng)于供試品溶液質(zhì)量的80%、100%及120%于上述3個(gè)容量瓶中，搖勻，按樣品溶液制備項(xiàng)下操作，進(jìn)樣、記錄色譜峰面積并計(jì)算回收率。見表1。

1.6 樣品測(cè)定

精密量取對(duì)照品與樣品溶液（批號(hào)：140608、140609及140610）各10μl，注入液相色譜儀，按上述方法測(cè)定，按照外標(biāo)法根據(jù)峰面積計(jì)算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

2 不確定度評(píng)定

2.1 不確定度來(lái)源分析

不確定度分量主要來(lái)源于測(cè)量過(guò)程中樣品與對(duì)照品的質(zhì)量不確定度、體積引入的不確定度、樣品回收率影響引入的不確定度、液相測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)帶來(lái)的不確定度。采用重復(fù)性研究數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)，將涵蓋所有樣品制備與檢測(cè)過(guò)程中隨機(jī)效應(yīng)及儀器操作、樣品基質(zhì)等因素的系統(tǒng)誤差所引起的不確定度進(jìn)行評(píng)定。

2.2 不確定度分量量化

2.2.1 試驗(yàn)方法精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度測(cè)定根據(jù)試驗(yàn)方法學(xué)對(duì)重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，采用公式（1）對(duì)測(cè)定方法中精密度不確定度進(jìn)行評(píng)定。

u（p）/p為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，RSDi為樣本i的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，ni為樣本i的重復(fù)測(cè)定次數(shù)

2.2.2 試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度測(cè)定u（Rm）/（Rm）試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度是通過(guò)加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定的，回收率不確定度按照公式（2）評(píng)定。

回收率試驗(yàn)中對(duì)照品溶液的配制是采用的是十萬(wàn)分之一電子天平精密稱量對(duì)照品12.9 mg定容于10 ml容量瓶中，采用2 ml移液管分別吸取0.8，1.0，1.2 ml加至樣品溶液中，所有引入的不確定度u（mspike）/（mspike）包括對(duì)照品稱量u（m）、對(duì)照品溶液配制u（V1）與對(duì)照品溶液的移取u（V2）共3部分所引入的不確定度。

電子天平稱量允許的誤差為±0.1 mg，對(duì)允許誤差采用矩形分布計(jì)算示值不確定度，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差采用正態(tài)分布的計(jì)算稱量重復(fù)性不確定度。國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程規(guī)定2 ml單標(biāo)移液管、10 ml量瓶的容量允許誤差分別為0.01及0.02 ml，樣品稀釋過(guò)程中校準(zhǔn)不確定度及量器允差按三角分布計(jì)算，采用試驗(yàn)中各規(guī)格量器重復(fù)吸取各標(biāo)稱容量蒸餾水共6次，以質(zhì)量所得出的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按正態(tài)分布計(jì)算其不確定度，對(duì)照品溶液配制的相對(duì)不確定度評(píng)定結(jié)果見表3。

2.2.3 計(jì)算對(duì)照品加入量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度不確定度u（Rm）根據(jù)公式2評(píng)定，結(jié)果Rm=99，97%，mobs=1.2896mg，量取對(duì)照品溶液相當(dāng)于供試品溶液質(zhì)量的80%、100%及120%進(jìn)行3組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)的方差分別為S1=0.0089 mg、S2=0.0028 mg、S3=0.0137 mg，所以合并方差Sp=0.0096 mg，u（mspike）/（mspike）=0.0077，u（Rm）/（Rm）=0.0081。

2.2.4 計(jì)算合成不確定度由上述各不確定度分量合成銀黃口服液中黃芩苷定量相對(duì)不確定度為[8]：

2.2.5 擴(kuò)展不確定度及報(bào)告不確定度95%置信概率下取包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度U95（W）=k×U=0.0240=2.40%。由實(shí)驗(yàn)所測(cè)銀黃口服液中黃芩苷的含量W=0.09449 mg/ml，故其擴(kuò)展不確定度為：U95=0.009449×0.0240=0.00023 mg/ml，本次實(shí)驗(yàn)所測(cè)銀黃口服液中黃芩苷的含量為：W=（0.09449±0.00023）mg/ml。

表3 對(duì)照品溶液配制的相對(duì)不確定度

3 討論

選取銀黃口服液為研究對(duì)象，建立其有效成分黃芩苷的含量測(cè)定方法，根據(jù)不確定度理論對(duì)回收率試驗(yàn)及方法重復(fù)性不確定度評(píng)定，并于95%可信空間下得出該法測(cè)定含量結(jié)果擴(kuò)展的不確定度為（W×2.40%）mg/ml，對(duì)試驗(yàn)方法可信度進(jìn)行定量描述，可作為銀黃口服液中測(cè)定黃芩苷含量方法學(xué)驗(yàn)證的補(bǔ)充[9]。

本實(shí)驗(yàn)不確定度分析中，從不確定度量化及表3對(duì)照品溶液配制的不確定可以看出，本方法測(cè)定黃芩苷結(jié)果各分量的不確定度均較小，而測(cè)量銀黃口服液中黃芩苷結(jié)果的不確定度主要來(lái)自測(cè)量過(guò)程中樣品與對(duì)照品的質(zhì)量不確定度、對(duì)照品溶液配制的不確定度、樣品回收率影響引入的不確定度等，其中影響最大的來(lái)自對(duì)照品溶液配制的不確定度[10]。因此在本實(shí)驗(yàn)操作中為減小操作過(guò)程中因?qū)嶒?yàn)操作者熟練程度產(chǎn)生的不確定度，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中還需增強(qiáng)操作者的實(shí)驗(yàn)操作熟練程度，并盡量避免小容量體積溶液的配制、量取、定容，從而減少因?qū)嶒?yàn)操作引入的不確定度。同時(shí)在數(shù)據(jù)分析中采用方差分析以進(jìn)一步判斷不確定度分析中一個(gè)獨(dú)立變量是否受到一個(gè)或多個(gè)變量因素的影響，從而判斷結(jié)果不確定度是一個(gè)因素的作用還是多個(gè)因素的交互作用，從而較真實(shí)的反映實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程對(duì)結(jié)果的影響，并避免復(fù)雜實(shí)驗(yàn)操作中對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)操作開展不確定度的分析，從而減少不確定度分析的工作量，以達(dá)到對(duì)各分量進(jìn)行快速準(zhǔn)確的不確定度分析的評(píng)估目的。

在藥物分析檢測(cè)評(píng)定不確定度時(shí)，應(yīng)盡可能的分析產(chǎn)生不確定度的所有可能來(lái)源。目前，分析測(cè)試領(lǐng)域中多采用對(duì)每個(gè)測(cè)定步驟的分析以得出測(cè)定結(jié)果的不確定度。但由于化學(xué)分析操作相對(duì)較復(fù)雜，需附加試驗(yàn)后再進(jìn)行B類不確定度的評(píng)定，而且其測(cè)定過(guò)程中對(duì)A類不確定度也較難評(píng)定，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部方法學(xué)驗(yàn)證法的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)定，通過(guò)采用方法學(xué)考察的準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)，整體考察檢測(cè)方法的不確定度，為實(shí)際生產(chǎn)中藥物分析提供參考。

[1]國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.測(cè)量不確定度評(píng)定與表示指南[M].北京:中國(guó)計(jì)量出版社,1999:34-42.

[2]中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求(GB/T27025-2008)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008:1-6.

[3]朱嘯風(fēng),孫欽美,劉景俊.銀黃口服液中黃芩苷和綠原酸含量的測(cè)定[J].齊魯藥事,2004,23(6):25-26.

[4]桑旭峰,吳海雯,徐奇超.HPLC同時(shí)測(cè)定銀黃口服液中綠原酸和黃芩苷含量[J].中成藥,2005,27(1):96-98.

[5]韋國(guó)兵,胡奇軍,廖夫生.HPLC法測(cè)定銀黃口服液中黃芩苷含量[J].江西師范大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(5):79-82.

[6]國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJF 1059-1999測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].北京:中國(guó)計(jì)量出版社,1999:1-11.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:1082-1083.

[8]韋國(guó)兵,胡奇軍,張秀秀.HPLC測(cè)定銀黃顆粒中綠原酸含量及不確定度分析[J].江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,26(5):60-63.

[9]李卓,李湘斌.反相HPLC法測(cè)定咽喉炎合劑中黃芩苷的含量[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2010,38(4):64-65.

[10]田冀媛.HPLC-MS法測(cè)定人血漿奧美拉唑的水平[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2008,36(3):52-55.

Determination of Baicalin in Yinhuang Oral Liquid by HPLC and evaluation of its measurement uncertainty

Ling-ling HE,Guo-bing WEI,Qi-jun HU
(Pharmacy College,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang,Jiangxi 330004,P.R.China)

【Objective】To establish a HPLC method for the determination of Baicalin in Yinhuang Oral Liquid and carry on the Uncertainty Analysis to the HPLC method.【Methods】The HPLC method is adopted to measure the content of Baicalin,and the data is verified in terms of methodology.Then the uncertainty,which is drawn into during the process of the determination,will be evaluated.As a result,the combined uncertainty can be worked out. The uncertainty is calculated under 95%confidence interval.【Results】The uncertainty of Baicalin in Yinhuang O－ral Liquid is 2.40%by adopting this method.【Conclusion】The HPLC method established for Baicalin is accurate and reproducible,and the established uncertainty analysis can be applied to the uncertainty analysis of high performance liquid chromatography method in the determination of active ingredient in drugs.

Yinhuang Oral Liquid;Baicalin;HPLC;uncertainty

1005-8982（2015）34-0015-04

R944.5

A

2015-03-12

江西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目（No：2014A008），江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥專項(xiàng)（No：ZX1013）