卞震炯，楊冬花

（1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

·論著·

益氣溫陽(yáng)活血方對(duì)慢性心力衰竭心室重塑患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Bax/Bcl-2表達(dá)的影響*

卞震炯1，楊冬花2

（1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

目的探討益氣溫陽(yáng)活血方對(duì)慢性心力衰竭心室重塑患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）BCL-2相關(guān)X蛋白（BCL2-Associated X Protein，Bax）/B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）表達(dá)的影響。方法將慢性心力衰竭患者122例隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，兩組均按慢性心力衰竭治療指南給予常規(guī)治療，治療組加服用益氣溫陽(yáng)活血方，治療共3個(gè)月。兩組治療前后分別以心臟超聲檢查患者左心室收縮末徑（LVESD）、舒張末徑（LVEDD）和左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法以及蛋白免疫印記法（Western-blot）檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果3個(gè)月后，與治療前比較，對(duì)照組、治療組治療后LVESD、LVEDD、Bax mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低，而LVEF、Bcl-2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平則升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且治療組治療后上述指標(biāo)與對(duì)照組治療后比較進(jìn)一步改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論益氣溫陽(yáng)活血方通過(guò)下調(diào)Bax基因表達(dá)以及上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)抑制慢性心力衰竭患者心室重塑，改善心臟功能。

心室重塑；Bax；Bcl-2；益氣溫陽(yáng)活血方；臨床研究

慢性心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿，也是最主要的死亡原因。近年來(lái)的研究表明，心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展及心室重塑方面起著重要作用[1]。Bax/Bcl-2為細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2與Bax的比例決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣溫陽(yáng)活血方可減少心力衰竭大鼠內(nèi)皮素-1、升高一氧化氮及一氧化氮合酶的水平，阻斷鈣調(diào)磷酸神經(jīng)激酶（calcineurin，CaN）信號(hào)通路活化抑制心室重塑[3-4]，但是否能通影響慢性心力衰竭患者PBMC Bax/Bcl-2的表達(dá)抑制心室重塑，目前尚不清楚。本研究通過(guò)觀察益氣溫陽(yáng)活血方對(duì)慢性心力衰竭心室重塑患者PBMC Bax/Bcl-2表達(dá)的影響，為進(jìn)一步臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2012年12月-2014年12月貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院及門診慢性心力衰竭患者122例，心功能II～I(xiàn)V級(jí)（依照紐約心臟病協(xié)會(huì)分級(jí)），所有病例診斷均參照2007年《中國(guó)慢性心力衰竭診斷治療指南標(biāo)準(zhǔn)》，按隨機(jī)分組原則分為慢性心力衰竭常規(guī)治療組（對(duì)照組）和慢性心力衰竭常規(guī)治療加益氣溫陽(yáng)活血方組（治療組）。治療組64例。其中，男34例，女30例；年齡53～84歲（66±10）歲；心功能II級(jí)22例，III級(jí)26例，IV級(jí)16例；冠心病28例，高血壓性心臟病18例，糖尿病性心肌病12，擴(kuò)張型心肌6例。對(duì)照組58例。其中，男31例，女27例；年齡54～83歲（65±11）歲；心功能II級(jí)20例，III級(jí)24例，IV級(jí)14例；冠心病26例，高血壓性心臟病17例，糖尿病性心肌病10，擴(kuò)張型心肌5例。兩組患者性別、年齡、體重指數(shù)、血壓、血脂、血糖及肝腎功能等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。排除先天性心瓣膜病、風(fēng)濕性心瓣膜病、甲亢性心臟病、結(jié)核性心包積液、慢性阻塞性肺疾病、非脂肪肝性肝功能不良、嚴(yán)重腎功能不全、近期1個(gè)月內(nèi)有重大創(chuàng)傷、手術(shù)、感染、腫瘤及血液疾病患者。所有入選者均征得同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器

淋巴細(xì)胞分離液（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所），Trizol（Invitroge公司），Rnasin（Promega公司），M-MLV（Promega公司），引物由上海生物工程公司合成，Bax和Bcl-2一抗抗體（Santa Cruz公司），ECL顯影試劑盒（Santa Cruz公司），制膠、電泳及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），PCR儀（Eppendorf公司），酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），超聲心動(dòng)圖診斷儀2500型（美國(guó)惠普公司）。

1.3 方法

1.3.1 治療方法兩組均按慢性心力衰竭治療指南給予常規(guī)治療，包括利尿劑、血管緊張素酶抑制劑、β受體阻滯劑及洋地黃等。治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，加用益氣溫陽(yáng)活血方，處方：人參30 g，黃芪30 g，桂枝9 g，丹參30 g，益母草30 g，紅花6 g，白術(shù)15 g，澤瀉9 g，茯苓15 g，葶藶子9 g，炙甘草6 g。每天1劑，水煎，頭煎加水500 ml，取汁150 ml，2煎加水400 ml，取汁100 ml，2煎混勻，分3次口服。兩組共用藥3個(gè)月。

1.3.2 心臟結(jié)構(gòu)及心功能測(cè)定兩組受試對(duì)象治療前和治療結(jié)束后采用惠普2500超聲心動(dòng)圖診斷儀，探頭頻率3.2 MHz，指定具有豐富經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員操作，測(cè)定左心室收縮末徑（Left ventricular end systolic diameter，LVESD）、舒張末徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）和左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），連續(xù)3次，取其平均值。

1.3.3 PBMC的分離取兩組受試對(duì)象治療前和治療結(jié)束后外周血4 ml，肝素抗凝，按淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)Ficoll密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.3.4 Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)Bax（500 bp）正向：5'-CCCACCAGCTCTGAACAGTTC-3'，反向：5'-C CAGCCACAAAGATGGTCAC-3'；Bcl-2（369 bp）正向5'-CTTCGCCGAGATGTCCAG-3'，反向5'-GGCTCA GATAGGCACCCA-3'；GAPDH（300 bp）正向5'-CAT CTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，反向：5'-ATCATGTTTG AGACCTTCAACA-3'。按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取PBMC總RNA，參照第一鏈cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、照相，利用UVP凝膠掃描儀測(cè)定條帶的吸光度（A）值，以目的基因與GAPDH條帶的吸光度（A）值的比值代表其表達(dá)的相對(duì)量。

1.3.5 Bax、Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)提取PBMC蛋白質(zhì)，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。一抗?jié)舛染鶠?∶1 000，二抗?jié)舛葹?∶2 000，化學(xué)發(fā)光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描并分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果為計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 19.0軟件分析處理，兩組治療后比較采用t檢驗(yàn)，同組治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P< 0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后心臟結(jié)構(gòu)、功能的比較

與治療前組內(nèi)比較，對(duì)照組和治療組治療后LVESD、LVEDD縮小，LVEF則均提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組治療后比較，治療組治療后LVESD、LVEDD縮小，LVEF則提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 兩組治療前后Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè)

與治療前組內(nèi)比較，對(duì)照組和治療組治療后Bax mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均降低，而B(niǎo)cl-2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平則均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組治療后比較，治療組治療后Bax mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低，而B(niǎo)cl-2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平則升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的瓊脂糖電泳圖和聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)電泳圖，見(jiàn)圖1～4。

表1 兩組治療前后心臟結(jié)構(gòu)、功能的比較（s）

表1 兩組治療前后心臟結(jié)構(gòu)、功能的比較（s）

注：1）與治療前組內(nèi)比較，P<0.05；2）與對(duì)照組治療后比較，P< 0.05

組別nLVEDD/mmLVESD/mmLVEF/%對(duì)照組治療前5859.69±2.7833.38±3.5144.17±4.03治療后治療組5857.62±3.081）30.54±2.851）47.00±3.771）治療前6460.04±3.0234.01±3.2143.37±4.32治療后6456.49±2.321）2）29.12±2.061）2）48.41±3.441）2）

表2 兩組治療前后Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè)（±s）

表2 兩組治療前后Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè)（±s）

注：1）與治療前組內(nèi)比較，P<0.05；2）與對(duì)照組治療后比較，P< 0.05

組別nBax mRNA（相對(duì)量）Bcl-2 mRNA（相對(duì)量）Bax蛋白質(zhì)（相對(duì)量）Bcl-2蛋白質(zhì)（相對(duì)量）對(duì)照組治療前580.79±0.080.65±0.105.05±1.143.02±1.03治療后治療組58 0.63±0.101）0.74±0.111）3.11±1.061）4.62±1.061）治療前640.79±0.090.66±0.104.93±1.272.99±0.98治療后64 0.60±0.101）2）0.78±0.101）2）2.77±0.731）2）5.03±1.121）2）

圖1 Bax mRNA的表達(dá)

圖2 Bax蛋白質(zhì)的表達(dá)

圖3 Bcl-2 mRNA的表達(dá)

圖4 Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在自身基因調(diào)控下進(jìn)行的一種主動(dòng)死亡過(guò)程，故又稱程序性細(xì)胞死亡[5]。近年研究表明，心力衰竭時(shí)左室功能的不斷惡化是心肌細(xì)胞反復(fù)丟失和（或）剩余心肌細(xì)胞收縮功能逐漸退化的結(jié)果，而心肌細(xì)胞死亡是心肌細(xì)胞不斷丟失的根源所在，心肌細(xì)胞死亡使心肌細(xì)胞大量丟失導(dǎo)致心室重塑和心力衰竭[6]。

Bcl-2家族是與細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)的基因家族，該家族的蛋白產(chǎn)物從功能上分為兩類：一類具有抑制凋亡作用，如Bcl-2基因，另一類則具有促進(jìn)凋亡作用，如Bax基因[7]。Bcl-2是從濾泡B細(xì)胞瘤中克隆出的第一個(gè)抑制凋亡的蛋白，主要位于線粒體膜、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜上，可抑制多種原因引起的細(xì)胞程序性死亡[8]；Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員，是一個(gè)可溶性蛋白分子，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)發(fā)生時(shí)，Bax從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體，并與線粒體膜相結(jié)合，發(fā)揮促凋亡作用，兩者蛋白水平的高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭心肌中Bcl-2蛋白表達(dá)下降92%，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)52%，Bcl-2與Bax蛋白的比例下降[10]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在延緩心力衰竭、改善患者臨床癥狀、對(duì)抗心力衰竭西藥的不良反應(yīng)上顯示了其獨(dú)特療效，并具有一定的優(yōu)勢(shì)。比如中醫(yī)藥在干預(yù)病理性心肌凋亡、細(xì)胞肥大和心肌纖維化等方面療效肯定，同時(shí)中醫(yī)藥協(xié)同西藥，既可消除或減少血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和β受體阻滯劑的不良反應(yīng)，又縮短了藥物劑量遞增的時(shí)間[11]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，益氣溫陽(yáng)活血方對(duì)慢性型力衰竭心室重塑患者凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以及心臟結(jié)構(gòu)和功能得到明顯改善，具體表現(xiàn)為促凋亡蛋白Bax的表達(dá)下調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，心臟射血分?jǐn)?shù)增加，左室舒張末期內(nèi)徑及左室收縮末期內(nèi)徑下降。有研究發(fā)現(xiàn)，CaN通過(guò)影響B(tài)ad的磷酸化，拮抗Bcl-2家族抗凋亡作用[12]，或活化轉(zhuǎn)錄因子活化T細(xì)胞核因子3，使其由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于胞核，介導(dǎo)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[13]。前期研究也發(fā)現(xiàn)，益氣溫陽(yáng)活血方可阻斷CaN信號(hào)通路活化抑制心室重塑[3]。故推測(cè)，益氣溫陽(yáng)活血方通過(guò)阻斷CaN信號(hào)通路活化，調(diào)節(jié)凋亡基因Bax、Bcl-2的表達(dá)，改善慢性心力衰竭患者心臟功能、抑制心室重塑。具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of Yiqiwenyanghuoxue decoction on Bax/Bcl-2 of PBMC in chronic heart failure patiens with cardiac remodeling

Zhen-jiong BIAN1,Dong-hua YANG2
(1.Department of Cardiology,the Second Affiliated Hospital of Guiyang Traditional Chinese Medicine College,Guiyang,Guizhou 550003,P.R.China;2.Cardre Ward,Guizhou People's Hospital,Guiyang,Guizhou 550002,P.R.China)

【Objective】To study the effects Yiqiwenyanghuoxue decoction on Bax/Bcl-2 of PBMC in the cardiac remodeling of patients with chronic heart failure.【Methods】122 patients with chronic heart failure were randomly divided into control group and treated group.The control group were given conventional treatment,the treated group were given Yiqiwenyanghuoxue decoction and combined routine therapy,three months was taken as a course of treatment.LVESD,LVEDD and LVEF were measured by ultrasonic cradiography,mRNA and protein levels of Bax and Bcl-2 were evaluated with RT-PCR and Western-blot respectively.【Results】After 3 months,LVEDD, LVESD,mRNA and protein levels of Bax were decreased while LVEF,mRNA and protein levels of Bcl-2 were increased in both therapy group compared with those pre-therapy(P＜0.05,respectively),and the above indicators got further improvement in treated group compared with control group(P<0.05,respectively).【Conclusion】Yiqiwenyanghuoxue decoction could inhibit the myocardial remodeling through down-regulating Bax and upregulating Bcl-2.

cardiac remodeling;Bax;Bcl-2;decoction of Yiqiwenyanghuoxue;clinical research

1005-8982（2015）34-0006-04

R286

A

2015-04-13

貴州省科技聯(lián)合基金項(xiàng)目（黔科合中藥字[2012]LKZ7009號(hào)）