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hFAM92A1在人宮頸癌細胞不同周期時相的表達*

網(wǎng)絡出版時間：2015-03-19網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0926.001.html

方娟1, 王珺1, 龔堅1, 王燕1, 阮緒芝2**

(1.湖北醫(yī)藥學院 基礎醫(yī)學研究所， 湖北 十堰442000； 2.湖北醫(yī)藥學院 科技處， 湖北 十堰442000)

[摘要]目的： 探討hFAM92A1在人宮頸癌HeLa細胞不同周期時相的表達差異。方法： 常規(guī)培養(yǎng)Hela細胞，應用血清饑餓法將HeLa細胞同步化于G1期，胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步化于S、G2期，秋水仙素阻斷法同步化于M期，應用流式細胞術(shù)檢測同步化效率，應用RT-PCR方法檢測hFAM92A1在人宮頸癌HeLa細胞不同周期時相的表達水平。結(jié)果： 流式細胞儀檢測細胞同步化效率G1期為77.5%、S期為85.5%、G2期為61.9%、M期為44%；FAM92A1基因在各期均有表達，但存在差異，以S期表達最高。結(jié)論： FAM92A1基因在HeLa細胞不同周期時相的表達有較大差異。

[關(guān)鍵詞]基因； 子宮頸； 癌； 細胞周期

細胞周期是指連續(xù)分裂的細胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂的整個連續(xù)的過程。細胞周期的運行受多個因素的影響，有2個調(diào)控點，一個是G1/S期轉(zhuǎn)折點，另一個是G2/M期轉(zhuǎn)折點，細胞周期失控運行將導致癌的發(fā)生。因此，增殖相關(guān)基因在腫瘤細胞周期調(diào)控中的作用研究是認識腫瘤發(fā)生機制的重要內(nèi)容。FAM92A1基因是在前期研究中發(fā)現(xiàn)的一個位于細胞核的基因[1-2]，在人多種正常組織和癌組織中廣泛表達，可能參與細胞周期調(diào)控。細胞周期調(diào)節(jié)異常是癌癥研究領域的一個熱點[4-8]。已有文獻報道宮頸癌有細胞周期失控現(xiàn)象存在。本實驗通過研究hFAM92A1在人宮頸癌HeLa細胞不同周期時相的表達差異，為研究hFAM92A1基因的生物學功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1　材料和儀器

人宮頸癌HeLa細胞株由本室保存，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，胸腺嘧啶核苷、秋水仙素購自Sigma公司, Trizol購自Invitrogin, RT-PCR引物由上海生工合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega，細胞周期檢測試劑盒購自凱基生物科技發(fā)展有限公司。所需儀器有CO2培養(yǎng)箱、低溫冷凍離心機(Eppendorf)、倒置顯微鏡(萊卡)、PCR儀(Eppendorf)、熒光定量PCR儀(ABI)，流式細胞儀(FAC Scalibur)，紫外分光光度儀(UV-3802)。

1.2　HeLa細胞培養(yǎng)及同步化

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞密度90%時，接種到6孔板中，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。G1期細胞同步化采用血清饑餓的方法，當細胞密度達80%時，換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)42 h后收集G1期細胞。S期細胞同步化采用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法，細胞密度達80%時,加入含終濃度為2 mmol/L胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 h，再加入含終濃度為2 mmol/L胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，換成10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h收集S期細胞；G2細胞同步化采用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法，在第二次阻斷釋放后培養(yǎng)9 h收集G2期細胞。M期細胞同步化采用秋水仙素阻斷法，細胞融合率達80%時，換成秋水仙素終濃度為1 mg/L的培養(yǎng)基,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 h后收集M期細胞。

1.3　細胞周期同步化效率檢測

收集到的各期細胞加75%的冰乙醇5 mL 4 ℃固定過夜，1 000 r/min離心5 min棄上清，加PBS洗滌,1 000 r/min離心5 min，棄上清，加100 μL RNaseA 37 ℃水浴30 min，加400 μL碘化丙定(PI)染色混勻，4 ℃避光30 min，用流式細胞儀檢測同步化效率。

1.4　細胞總RNA的提取

收集到的各期細胞分別加500 μL Trizol液充分裂解細胞，收集到無RNA酶的EP管中，加入100 μL氯仿，室溫靜置3 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,吸取上清，加入等體積的異丙醇，劇烈震蕩15 s，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入預冷75%乙醇800 μL，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清，干燥5 min，加入無RNA酶水20 μL，取1 μL RNA，按照1∶50的比例稀釋后用紫外分光光度儀檢測A260和A280的值，對總的RNA濃度進行定量分析，余下的放-80 ℃保存。

1.5　RT-PCR

收集同步化的各個周期時相的細胞，以不做任何處理HeLa細胞為對照，以GAPDH為內(nèi)參，檢測HeLa細胞中FAM92A1的表達。按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，取1 000 ngRNA為模板，總體積為20 μL，逆轉(zhuǎn)錄條件，70 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，-20 ℃保存；RT-PCR，將上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍后取2 μL為模板，反應總體積為25 μL，反應條件為95 ℃ 2 min預變性，95 ℃ 15 s，55 ℃ 22 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 5 min，36循環(huán)，用瓊脂糖凝膠方法分析。

2結(jié)果

2.1　總RNA純度

外分光光度儀檢測吸光度結(jié)果，G1期A260值為0.245,A260/A280比值為 1.91;S 期A260值為0.320,A260/A280比值為2.01;G2 期A260值為0.224,A260/A280比值為1.95;M期A260值為0.106,A260/A280比值為1.96。電泳結(jié)果清晰顯示5 S、18 S、28 S三個條帶，且18 S和28 S的灰度比為1∶2，表明所提RNA純度很高，能夠滿足下一步實驗要求。見圖1。

注：DL2000為標準分子量參照物大小為2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp，Hela細胞1-5分別為正常，G1、S、G2、M各時相圖1　Hela細胞總RNA電泳圖Fig.1　Electrophoresis of total RNA of HeLa cells in each phase

2.2　HeLa細胞同步化效率檢測

HeLa細胞各期同步化后，經(jīng)流式細胞儀檢測，G1期同步化效率為 77.5%，S期同步化效率為 85.5%，G2期同步化效率 61.9%，M 期同步化效率為44%。

2.3　FAM92A1表達

RT-PCR結(jié)果顯示FAM92A1的表達隨細胞周期時相的變化而存在差異，以S期表達量最高(如圖2)。

1~5為對照、M期、G2期、S期及G1期HeLa細胞中FAM92A1的表達， 6~10為對照、M期、G2期、S期及G1期HeLa細胞中GAPDH內(nèi)參的表達圖2　HeLa細胞不同周期時相FAM92A1基因的表達Fig.2　FAM92A1 gene expression of HeLa cells in different phases

3討論

FAM92A1基因是近期發(fā)現(xiàn)的一個新基因，與細胞增殖關(guān)系密切，在正常生長旺盛的組織和腫瘤組織中高度表達，參與細胞周期調(diào)控[10]，但是其生物學功能目前尚不明確。

細胞正常的分裂、增殖、分化與衰老維持著機體的穩(wěn)定，細胞周期的異常會導致這一過程的紊亂。許多生長因子、細胞因子、激素及癌基因產(chǎn)物對DNA代謝的調(diào)節(jié)都是通過影響細胞周期實現(xiàn)的，許多基因的表達又受到細胞周期的制約。調(diào)控細胞周期的核心因子就是細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK，cyclin dependent kinase)，它與不同的細胞周期蛋白形成多種復合物，作用于細胞周期的不同時相，決定著細胞周期的進程。而近幾年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的多種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(CKI，cyclin dependent kinase inhibitor)，更加深了對腫瘤發(fā)生機制的了解。

基因突變或基因表達異常是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。為了深入研究FAM92A1基因的生物學功能，本研究從細胞周期入手，首先通過細胞同步化方法，將細胞同步化于G1,S,G2,M期，運用流式細胞儀檢測同步化效率，接著運用RT-PCR證實FAM92A1在HeLa細胞各個時相均有表達，以S期表達量最高，G1,G2,M期表達較低，這種各時相表達的差異性可能與FAM92A1在細胞周期中所起的調(diào)控作用關(guān)系密切。又知S期細胞的主要活動是進行DNA復制，DNA復制完成與否直接影響細胞增殖周期的運行，hFAM92A1基因過表達時發(fā)生S期阻滯，提示其與DNA復制有關(guān)。那么FAM92A1基因在其它腫瘤細胞各時相的表達及其具體的生物學功能又是怎么樣的？有待于進一步的研究。

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(2014-12-06收稿，2015-02-21修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 趙毅

Expression of hFAM92A1 in Different Cell Cycle Time Phases

of Human Cervical Carcinoma HeLa Cells

FANG Juan1, WANG Jun1, GONG Jian1, WANG Yan1, RUAN Xuzhi2

(InstituteofBasicMedicine,HubeiMedicalCollege,Shiyan442000,Hubei,China; 2.DivisionofScienceand

Technology,HubeiMedicalCollege,Shiyan442000,Hubei,China)

[Abstract]Objective: To investigate the expression differences of hFAM92A1 in different cell cycle time phases of HeLa cells of human cervical carcinoma. Methods: HeLa cells were conventionally cultured and synchronized in G1 phase using serum starvation, synchronized in G2 and S phase using double thymidine blocking, synchronized in M phase using colchicine blocking, and synchronizing efficiency was tested by flow cytometry. RT-PCR method was adopted to detect the expression of hFAM92A1 in different cell cycle phases of HeLa cells. Results: Flow cytometry instrument detected cell synchronization efficiency as follows： G1 phase 77.5%, S phase 85.5%,G2 phase 61.9%，M phase 44%. FAM92A1 genes were expressed in each period but with differences, the highest expression was in S phase. Conclusions: FAM92A1 gene of HeLa cell expression in different cycle phases exhibit notable differences.

[Key words]genes; cervix uteri; carcinoma; cell cycle

[中圖分類號]R737.33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)03-0304-03

通信作者**E-mail:ranxuzhi@163.com

[基金項目]*湖北醫(yī)藥學院碩士啟動金項目(No：2012ZRQDJ09)