*基金項目: 新會區(qū)科技局項目(新科[2014]523號)；江門市科技局項目(江科[2014]77號)。

**第一作者：昌水平,男,副主任中藥師。Tel：(0750)6621115，E-mail:zyysbk001@126.com。

★　昌水平1**　張健民1　王琦2　梁志云1　(1.江門市新會區(qū)中醫(yī)院　廣東 江門 529100；2.江門市藥品檢驗所　廣東 江門 529000)

蛇傷藥酒的薄層鑒別及其鹽酸小檗堿含量測定*

*基金項目: 新會區(qū)科技局項目(新科[2014]523號)；江門市科技局項目(江科[2014]77號)。

**第一作者：昌水平,男,副主任中藥師。Tel：(0750)6621115，E-mail:zyysbk001@126.com。

★昌水平1**張健民1王琦2梁志云1(1.江門市新會區(qū)中醫(yī)院廣東 江門 529100；2.江門市藥品檢驗所廣東 江門 529000)

摘要：目的：研究蛇傷藥酒的質(zhì)量控制方法。 方法：采用薄層色譜法(TLC)對制劑中大黃進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)測定鹽酸小檗堿的含量，Diamonsil C18(2)色譜柱(200mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液(32:68)，檢測波長為345nm，流速為1.0mL/min，柱溫為25℃。 結(jié)果：定性鑒別薄層色譜斑點特征明顯；高效液相色譜法測定鹽酸小檗堿含量，在0.04～0.42μg范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：Y=0.6156X-0.0776(r=0.9999)，平均加樣回收率為99.71%，RSD=1.44%(n=6)。 結(jié)論：采用TLC法對大黃定性鑒別，HPLC定量測定鹽酸小檗堿含量，兩方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，可有效控制該制劑質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：蛇傷藥酒；高效液相色譜法；薄層鑒別；鹽酸小檗堿

蛇傷藥酒是我院已故老蛇醫(yī)翁東成先生臨床治療蛇傷的驗方制劑，由大黃、黃連、五靈脂、吳茱萸、東風(fēng)菜、金線風(fēng)等味藥材組成，用于治療各種毒蛇咬傷，蜈蚣、蚊、蟲叮咬傷，臨床效果良好。為有效控制其質(zhì)量，本文根據(jù)《中國藥典》2010年版一部[1]大黃項下薄層鑒別方法、黃連項下含量測定方法，在其基礎(chǔ)上，作了適當(dāng)調(diào)整，建立蛇傷藥酒的定性、定量檢測方法。經(jīng)實驗研究表明，本實驗方法簡便易行、重現(xiàn)性好，可用于蛇傷藥酒的質(zhì)量控制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1儀器和試藥

1.1儀器戴安U3000高效液相色譜儀(美國)；KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLER TOLEDO 1/100000天平(瑞士)；數(shù)顯智能4孔水浴鍋(上?？德穬x器設(shè)備有限公司);Good see-I薄層色譜攝影儀(上?？普苌锟萍加邢薰?;MILLIPORE超純水器(廣州東銳科技有限公司)。

1.2試藥大黃對照藥材(批號：120984-201202),大黃酚對照品(批號：110796-201319),鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201212),三者均購自中國藥品生物制品檢定所；蛇傷藥酒(江門市新會區(qū)中醫(yī)院配制，規(guī)格：100mL/瓶，批號：20140512、20140814、201401125)；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1大黃薄層鑒別

2.1.1供試品制備取蛇傷藥酒50mL，濃縮至約30mL，加鹽酸0.5mL，水浴溫?zé)釘?shù)分鐘，加三氯甲烷萃取2次(15,10mL)，合并三氯甲烷液，蒸干，甲醇溶解，得供試品溶液。

2.1.2對照品制備取大黃酚對照品2.0mg，加甲醇溶解并定容至2mL容量瓶中，即得對照品溶液。

2.1.3陰性對照品制備取不含大黃藥材的蛇傷藥酒，以“2.1.1”供試品項下方法制備，得陰性對照溶液。

2.1.4薄層鑒別方法 吸取對照品溶液和供試品溶液各2μL，分別點于硅膠薄層板上，展開劑為石油醚(60～90℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上層溶液[2]，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視，結(jié)果見圖1。

(1-大黃酚對照品；2,3,4-3批供試品溶液；5-大黃對照藥材；6-陰性對照)

圖1大黃TLC圖

2.2鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil C18(2)柱(200mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液(32:68)；檢測波長：345nm；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：25℃。

2.2.2溶液的制備

2.2.2.1供試品溶液 精密吸取蛇傷藥酒2mL，精密加入鹽酸：甲醇(1:100)混合溶液10mL，蒸干，殘渣用甲醇適量使溶解，加在堿性氧化鋁柱(100～200目，8g，內(nèi)徑為1cm)上，用甲醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，甲醇溶解定容至10mL容量瓶中，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

2.2.2.2對照品溶液精密稱取鹽酸小檗堿對照品約10mg，置50mL容量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，作為鹽酸小檗堿對照品溶液儲備液。精密吸取上述鹽酸小檗堿甲醇溶液1mL置20mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為鹽酸小檗堿對照品溶液，濃度為10.53μg/mL。

2.2.2.3陰性對照溶液取不含黃連、黃柏藥材的蛇傷藥酒，以“2.2.2.1”項下方法制備，得陰性對照溶液。

2.2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗考察在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀，測定。結(jié)果表明，供試品圖譜與對照品圖譜在同一保留時間處有相同色譜峰，且光譜圖一致，陰性對照無干擾。見圖2。

2.2.4線性關(guān)系精密量取0.4,0.8,1.0,2.0,4.0mL鹽酸小檗堿對照品溶液儲備液，分別置于20mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為6.2120，12.4240，24.5300，49.0600，98.1200μg/mL的溶液。分別精密吸取10μL注入HPLC，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，以鹽酸小檗堿進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y積分值為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程：Y=0.6156X-0.0776，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。結(jié)果表明鹽酸小檗堿在0.04～0.42μg范圍內(nèi)與其相應(yīng)的峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗精密吸取“2.2.2.1”項下鹽酸小檗堿對照品溶液10μL，按“2.2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測定鹽酸小檗堿對照品峰面積值的RSD為0.39%，表明精密度良好。

2.2.6溶液穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液 10μL，注入液相色譜儀，每隔6h測定一次，考察24h，再于48h考察一次。試驗結(jié)果表明，蛇傷藥酒供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定，供試品中鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.08%(n=6)。

圖2　HPLC圖譜(A．鹽酸小檗堿對照品;B．蛇傷藥酒供試品;C．陰性對照)

2.2.7重復(fù)性試驗精密量取蛇傷藥酒2mL，共5份，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定峰面積，并計算鹽酸小檗堿的含量。鹽酸小檗堿的平均含量為0.0503mg/mL，RSD為1.43%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8回收率試驗采用加樣回收法試驗。取已知鹽酸小檗堿含量的蛇傷藥酒(批號：20140512，鹽酸小檗堿的含量為0.0503mg/mL)，精密量取1mL，共6份，分別置10mL量瓶中，分別加入一定量的鹽酸小檗堿對照品，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定峰面積，并計算鹽酸小檗堿的含量。計算結(jié)果鹽酸小檗堿的平均回收率為99.71%，RSD為1.44%。

2.2.9樣品含量測定精密吸取20140512,20140814,20141125批次蛇傷藥酒2mL，從精密加入鹽酸：甲醇(1:100)混合溶液10mL起，按“2.2.2.2”項下處理方法配置，精密吸取供試品溶液與對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，外標(biāo)法計算樣品中鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表1。

表1　蛇傷藥酒中鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果(n=3)

3討論

3.1研究過程中對供試品溶液的制備方法進(jìn)行了考察，包括提取溶媒、是否通過氧化鋁色譜柱凈化，以及洗脫溶劑的種類和體積數(shù)量，結(jié)果顯示，以“2.2.2.2”項下方法制得的供試品溶液色譜雜峰較少，分離效果好，完全滿足藥典定量分析的要求。

3.2根據(jù)《中國藥典》2010版一部“黃連”含量測定項下流動相條件進(jìn)行調(diào)整，選用乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液(32:68)為流動相對本品進(jìn)行試驗，所得色譜圖的分離度好，保留時間適宜。

3.3試驗結(jié)果表明，薄層色譜法鑒定大黃斑點清晰，且陰性對照無干擾；高效液相色譜法測定鹽酸小檗堿含量，其精密度RSD為1.08%(n=5)；穩(wěn)定性RSD為1.08%(n=6)；重復(fù)性RSD為1.43%(n=5)；加樣平均回收率為99.71%，RSD為1.44%(n=6)，均能滿足定量的要求。故本方法可用于蛇傷藥酒的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:22,285.

[2]林子安，昌水平, 劉庭恩,等.拔毒消炎軟膏質(zhì)量控制研究[J].蛇志，2014.26(2): 153-155.

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TLC Identification and Determination of Berberine Hydrochloride by HPLC in Sheshang Medicinal Liquor

CHANG Shui-ping1，ZHANG Jian-min1，WANG Qi2，LIANG Zhi-yun1

1.JiangmenXinhuiHospitalofTraditionalChineseMedicine，Jiangmen529100，China；

2.JiangmenInstituteforDrugControl，Jiangmen529000，China.

Abstract:Objective:To study the method of quality control for Sheshang medicinal liquor. Methods: The thin layer chromatography(TLC) was used to the qualitative identification of rheum officinale; the quantitative analysis of berberine hydrochloride was carried out by HPLC with a Diamonsil C18(2) chromatograhpic column(200mm×4.6mm，5μm),the mobile phase was acetonitrile - 0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate solution (32:68) with the flow rate of 1.0 mL/min and the detection wavelength of 345nm,the temperature of column was 25℃. Results:The characteristic of TLC spots was obvious in the qualitative identification. HPLC determind the content.The berberine hydrochloride in 0.04～0.42μg extent show good linear ralation,and the regression equation was Y=0.6156X-0.0776，(r=0.9999) with an average recovery rate of 99.71%(RSD=1.44%, n=6). Conclusion:The methods of using TLC and HPLC are simple and accurate, and can be used for the quality control of Sheshang medicinal liquor.

Key words:Sheshang Medicinal Liquor; HPLC; TLC;Berberine Hydrochloride;Methodology

收稿日期：(2015-06-02)編輯：曾文雪

中圖分類號：R286.0

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B