謝守嬪 ，羅 佳 ，李海龍 ，吳紅彥 △

1蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2蘭州市中醫(yī)醫(yī)院；3甘肅中醫(yī)藥大學;4甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室

當歸是已廣泛使用的藥物，當歸及其提取物在實驗研究中也體現(xiàn)出對Aβ誘導的神經(jīng)毒性有保護作用，但對Aβ誘導的神經(jīng)細胞凋亡卻未見報道。因而，本實驗擬以Aβ25-35誘導PC12細胞復制阿爾茨海默病細胞模型為對象，采用具有養(yǎng)血、活血、調(diào)肝的當歸含藥血清以不同濃度加以干預，從細胞活力、細胞膜的損傷和細胞凋亡的變化入手，探索其藥理機制，為進一步篩選當歸有效組份提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞 SPF級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(300±20)g，由甘肅中醫(yī)學院科研實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2004-0006-0000994，實驗設(shè)施使用許可證編號：SYXK(甘)2004-0006-0000308。動物分籠飼養(yǎng)，食固體飼料，飼料由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心提供，食水自由，室溫20～25℃，相對濕度45%～52%。PC12細胞(中分化)購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗藥品與試劑 中藥材當歸：購于甘肅蘭州老字號“復興厚”藥材公司；DMEM：Sigma公司，批號：NVL0337。細胞培養(yǎng)液：將DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%雙抗，0.22μm濾器過濾除菌，PH 7.2～7.4，4℃保存。磷酸鹽緩沖液(PBS)：購于gibico公司，批號：20101025；用雙蒸水定容至1 000 mL，0.22μm濾器過濾除菌，PH為 7.2～7.4，4℃保存。Hanks：Solarbio，批號：H1025。胎牛血清：杭州四季青公司，批號：100528；56℃滅活30分鐘，無菌分裝，-20℃保存，使用前經(jīng)4℃、室溫、37℃緩慢溶解備用。胰蛋白酶：購于鵬程公司，批號：0458；用PBS液配制成濃度為0.25%溶液，0.22μm濾器過濾除菌，4℃保存。四氮唑藍(MTT)：購于鵬程生物工程公司，批號：0793；用pH為7.4的PBS溶解，用時配成終濃度5 mg/mL的溶液，4℃避光保存。二甲基亞砜(DMSO)：購于鵬程公司。LDH試劑盒：購于南京建成生物工程研究所，批號：20101025。Aβ25-35：sigma公司，批號：108k4794。Anncxin V/PI試劑盒：杭州聯(lián)科生物公司，批號：JK100929。

1.3 Aβ配制方法 將1mg Aβ25-35溶解于BPS液中，配制成濃度為1mmol／L母液。儲存于-30℃冰箱中備用。使用時將其稀釋至100μmol/L，并置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中3～7天以增強其毒性。

1.4 細胞培養(yǎng) PC12細胞株完全培養(yǎng)液為DMEM+10%(體積比)胎牛血清+青鏈霉素，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4天傳代1次。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。

1.5 實驗分組 正常組：只加細胞懸液，不加任何處理因素；模型組：取20μmol/L終濃度的A β25-3530μL處理細胞24小時；空白血清組：用空白血清組加入空白血清30μL預處理24小時后加入20μmol/L終濃度Aβ25-3530μL共同孵育24小時；藥物組：當歸10倍(當歸高劑量組)，5倍(當歸中劑量組)，正常劑量(當歸小劑量組)3組含藥血清30μL預處理24小時后加入20μmol/L終濃度Aβ25-3530μL共同孵育24小時。

1.6 MTT法測細胞活力 取對數(shù)生長期PC12細胞，消化、離心后用完全培養(yǎng)液重懸，濃度為1×104μmol/mL，接種于96孔板，每孔加細胞培養(yǎng)液100μL，細胞貼壁后，吸取舊的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個平行樣本，按上述分組處理后，各孔吸去上清液20μL，加濃度為 0.5mg/mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后每孔加200μL二甲基亞楓，震蕩8分鐘，使紫色結(jié)晶充分溶解，空白孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測儀上測每孔吸光度即OD值(檢測波長570 nm)。

1.7 LDH測定 取對數(shù)生長期PC12細胞，經(jīng)胰酶消化后，吹打成單細胞懸液，將細胞按照以1×105/孔的密度接種于96孔板，每孔加細胞培養(yǎng)液90μL，每組設(shè)8個平行樣本，根據(jù)實驗分組處理后，按LDH試劑盒說明進行標本的測定。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)。LDN活性 =(ODu-ODc)/(ODs-ODb)×Cs×N×1000式中：ODu為測定管吸光度值、ODc空白管吸光度值、ODs為標準管吸光度值、ODb為對照管吸光度值、Cs為標準濃度(2mmol/L)、N為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡 1)取對數(shù)生長期PC12細胞(1×105/孔)，接種于6孔板，實驗分組如前處理；2)處理后經(jīng)胰酶消化、吹打成單細胞懸液，移入離心管中；3)將離心管于1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS漂洗1次后，重復離心洗滌一次；4)依據(jù)試劑盒說明進行操作，將細胞重懸于500μL binding buf fer中，再分別加入5μL的AnnexinV-FITC溶液和10μLP1染液，避光于室溫放置5分鐘；5)轉(zhuǎn)至流式檢測管，上機檢測，實驗同法重復3次。

1.9 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料采用(χ±s)表示，采用單因素方差分析(F檢驗)，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細胞形態(tài)學觀察 正常組PC12細胞生長速度快，貼壁良好，大多伸出長的軸突，容易成簇生長。在模型組中細胞明顯損傷，數(shù)量顯著減少，可見PC12細胞腫脹、圓縮，突起回縮，貼壁功能下降，有脫壁漂浮現(xiàn)象。

2.2 MTT檢測結(jié)果 MTT法測定各實驗組的OD值顯示，模型組所測的OD值為(0.64±0.40)，空白血清組(0.78±0.14)，2組沒有差異；空白組的OD值為 (1.35±0.27)，與模型組比較有顯著性差(P＜0.01)，顯示造模成功；當歸小、中、大3個劑量組OD值均比模型升高，其中高劑量組與小劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

表1 當歸大鼠含藥血清對Aβ25-35損傷PC12細胞的OD值和LDH活性的影響(χ±s)

2.3 LDH檢測結(jié)果 測定各實驗組LDH的OD值顯示，模型組所測的OD值為(875.5±102.27)，空白血清組(832.72±186.5)，2組沒有差異；空白組的OD值為(438.47±99.84)，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，顯示造模成功；當歸小、中、大3個劑量組OD值均比模型升高，其中高劑量組與小劑量組比較有明顯差異，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，中劑量組與小劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

2.4 細胞凋亡檢測結(jié)果 與模型組比較，空白組有顯著性差異，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，顯示造模成功；當歸小、中、大3個劑量組細胞活力均比模型升高，各當歸組與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與當歸小劑量組與大劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2和附圖1-6。

表2 當歸大鼠含藥血清對Aβ25-35損傷PC12細胞活力和凋亡率的影響(χ±s)

圖1 -6 當歸大鼠含藥血清對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的影響

3 討論

當歸性味甘、辛、苦而溫，入肝、心、脾經(jīng)。《本草》云：“當歸，治一切氣，補一切血，破惡血，養(yǎng)心血。”《景岳全書·本草正》載：“當歸，其味甘而重，故專能補血；其氣輕而辛，故又能行血。補中有動，行中有補，誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也?！笨梢姰敋w既可益陰血而補肝體，養(yǎng)血安神，又可舒肝氣而助肝用，調(diào)氣機而暢情志，氣血同調(diào)，心肝并治，對老年性癡呆精神與行為失常的防治具有很好的理論針對性。

本實驗結(jié)果表明，在Aβ25-35誘導的作用下，PC12細胞發(fā)生顯著的凋亡，當歸各含藥血清能升高PC12細胞的活力，降低 LDH釋放，對Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡有明顯的保護作用。有報道，采用大劑量當歸治療腦中風后遺癥，其不僅能改善后遺癥，且能明顯改善中風患者出現(xiàn)的記憶力減退等認知功能障礙，并未見明顯副作用［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，當歸可清除體內(nèi)氧自由基，抗脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)，具有明顯的抗衰老功能［2-11］；當歸能降低血管性認知障礙大鼠腦組織中AChE含量，升高其血中SS含量，體現(xiàn)出對中樞膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)活性和數(shù)量的調(diào)節(jié)作用［12］；當歸提取物可劑量依賴性地減弱Aβ1-42誘導的神經(jīng)毒性和tau蛋白磷酸化，同時，它能增加Akt的絲氨酸磷酸化水平，并下調(diào)GSK-3β活性，說明當歸提取物保護神經(jīng)細胞的作用與PI3K/Akt/GSK-3β信號通路有關(guān)［13］；當歸根的乙醇提取物對Aβ誘導的神經(jīng)毒性有保護作用，并能升高線粒體跨膜電位Del taPsim［14］。關(guān)于當歸抗凋亡的保護作用，仍有待進一步深入研究。

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