范陽華，葉敏華，吳 雷，何 偉，廖長春，汲乾坤，祝新根

（南昌大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西南昌 330006）

腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有無控性增殖、侵襲性生長、易復發(fā)的特點［1-2］。其本質上是一種多基因異常疾病，由于原癌基因的過表達，同時伴隨抑癌基因的突變缺失，從而使腫瘤細胞逃避了正常生長的調控機制。傳統(tǒng)治療方法（包括手術、化療和放療）并沒有完全解決膠質瘤侵襲性生長所導致的高復發(fā)率和低治愈率的難題。針對與膠質瘤發(fā)生、發(fā)展相關的基因異常的治療已成為研究熱點［3］。

真核細胞中存在一種小的泛素樣小分子修飾因子（small ubiquitin-like modifier，SUMO）-1，其對蛋白質的修飾作用是調節(jié)細胞中蛋白質與蛋白質的相互作用和轉錄活性、增強底物的穩(wěn)定性或影響靶蛋白亞細胞定位［4-6］?；蛐酒芯拷Y果顯示，缺氧培養(yǎng)的細胞中SUMO-1mRNA的表達表現(xiàn)為時間依賴性的增加。缺氧應激研究發(fā)現(xiàn)，許多SUMO-1的底物與轉錄或者翻譯后的調節(jié)相關，并可能通過與泛素或者其它修飾因子競爭HIF-1α上依賴于氧氣降解結構域上的賴氨酸殘基，阻斷蛋白質的泛素化-蛋白酶體降解途徑或者其他途徑，增加HIF-1α的穩(wěn)定性及其轉錄活性［7］，提示SUMO-1在缺氧應答中扮演重要角色［8-9］。

研究發(fā)現(xiàn)，RSUME可通過SUMO化促進腫瘤血管新生［10-11］。RSUME是一種新發(fā)現(xiàn)的可促進蛋白SUMO化作用的基因片段［12］，但膠質瘤中缺氧應激促進SUMO化及其引起HIF-1α／VEGF通路的調節(jié)過程及機制尚不明確。本研究通過檢測不同級別膠質瘤組織和正常腦組織中RSUME及其SUMO化的表達水平與HIF-1α／VEGF信號通路的關系，為深入研究膠質瘤的分子病理機制及臨床治療提供線索。

1 材料與方法

1．1 標本來源及臨床資料 收集南昌大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科自2010年1月至2013年1月手術切除并經(jīng)病理檢測證實的腦膠質瘤標本63例，其中男性41例，女性22例，年齡23～69歲，平均49．6歲。并按照世界衛(wèi)生組織（2007年）神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準對以上腫瘤組織進行分級：28例低級別腦膠質瘤包括9例低級別星形細胞瘤（WHOⅠ～Ⅱ級）和19例少突膠質細胞瘤（WHOⅡ級）；35例高級別膠質瘤包括13例間變性星形細胞瘤（WHOⅢ級）和22例膠質母細胞瘤（WHOⅣ級）。正常對照組為顱腦外傷手術切除的正常腦組織（9例），所有患者術前均未經(jīng)放化療。本研究獲得所有患者的知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員審核通過，術中標本在手術顯微鏡輔助下用取瘤鉗取出。

1．2 標本采集 切取腫瘤組織時避開囊變、壞死部位，所有標本在離體10min內取材，一份裝入含RNA保存液的無酶Eppendorf（EP）管中，并立即置于液氮中備用RT-PCR檢測，另一份40g／L的多聚甲醛固定48～72h，自來水充分沖洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，4μm連續(xù)切片備用免疫組化染色。

1．3 方法

1．3．1 免疫組織化學SP法染色 兔抗人SUMO-1（C0372）購于美國 ANBO 公司，兔抗人 HIF-1α（BA0912-2）、兔抗人 VEGF（BA0407）、SP染色試劑盒均購自武漢博士德公司。30mL／L H2O2阻斷過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，100mL／L胎牛血清孵育20min，分別加入SUMO-1（C0372，Anbo Biotechnology Company）、HIF-1α抗體（3716，cell signaling technology）4℃過夜孵化，PBS再次沖洗3次；加入生物素?；梗跤?h，PBS沖洗3次；加入辣根過氧化物酶標記生物素孵育2h，DAB顯色，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗為陰性對照，以已知陽性片（公司提供）作為陽性對照。

1．3．2 RT-PCR檢測 取組織100mg組織在液氮中磨碎成粉末狀，每100mg的組織加總RNA抽提試劑Trizol（購置于TransGen Biotech）1mL，并按步驟加入氯仿、異丙醇、無水乙醇提取總RNA。用紫外分光光度計測定核酸吸光度A260和A280值，測定組織總RNA濃度和純度。按逆轉錄試劑盒（購置于日本，TaKaRa公司 ）合成cDNA，逆轉錄條件：37℃反應15min，85℃反應5s。配置擴增體系：RSUME、HIF-1α、VEGF、內參上游、下游引物（引物序列見表1）各1μL，10μL 2×Taq PCR MasterMix（TransGen Biotech），擴增反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，58．8℃退火30s，72℃延伸30s，擴增35個循環(huán)；最后72℃延伸8min；PCR擴增產(chǎn)物取5μL，經(jīng)15g／L瓊脂糖凝膠電泳；凝膠成像分析系統(tǒng)進行拍照，熒光灰度分析。用Image-Pro Plus（IPP）軟件平均積分吸光度值（IA）分析，以內參強度值標化RSUME、HIF-1α及VEGF，得到各條帶與相應GAPDH條帶的強度比值為最后表達值，各組結果以±s表示。

表1 RSUME、HIF-1α、VEGF、GAPDH、PCR引物序列Tab．1 The PCR primer sequence of RSUME，HIF-1α，VEGF and GAPDH

1．3．3 隨訪 隨訪全部患者，無失訪，隨訪時間：18～45個月，記錄患者無進展生存期（progress free survival，PFS）。

1．4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20．0統(tǒng)計軟件進行處理，多組均數(shù)比較方差齊則采用方差分析（F值），方差不齊則采用非參數(shù)檢驗（H 值），其兩兩比較采用LSD法；SUMO-1、HIF-1α、VEGF在正常腦組織、低級別膠質瘤、高級別膠質瘤中的表達采用非參數(shù)檢驗（H 值）；SUMO-1、HIF-1α、VEGF 蛋白表達相關性采用Spearman等級相關分析，生存分析單因素采用Kaplan-Meier計算、Log-rank檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 RSUME、HIF-1α、VEGF mRNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果 35例高級別膠質瘤組織、28例低級別膠質瘤組織中可見 RSUME、HIF-1α、VEGF mRNA的表達，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)在348 bp、80bp、240bp處分別可見 RSUME（A）、HIF-1α（B）、VEGF（C）、RT-PCR產(chǎn)物的清晰條帶，周圍無雜帶（圖1）。

2．2 RSUME、HIF-1α、VEGF mRNA在高、低級別膠質瘤及正常腦組織中的表達情況 RSUME mRNA表達水平：高級別膠質瘤為1．12±0．23，低級別膠質瘤為0．78±0．14，正常腦組織為0．51±0．06，3組比較有統(tǒng)計學差異（χ2＝49．289，P＜0．001），并且兩組間比較均有統(tǒng)計學差異，即隨膠質瘤惡性程度的增高，RSUME mRNA表達增高。HIF-1αmRNA表達水平：高級別膠質瘤為0．81±0．10，低級別膠質瘤為0．53±0．09，正常腦組織為0．27±0．08，3組比較有顯著性差異（F＝121．141，P＜0．01），并且兩組間比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0．01），即隨膠質瘤惡性程度的增高，HIF-1αmRNA表達增高。VEGF mRNA表達水平：高級別膠質瘤為0．78±0．17，低級別膠質瘤為0．39±0．11，正常腦組織為0．19±0．05，3組比較有統(tǒng)計學差異（χ2＝56．412，P＜0．001），并且兩組間比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0．01），即隨膠質瘤惡性程度的增高，VEGF mRNA表達增高（表2）。

圖1 RSUME（A）、HIF-1α（B）、VEGF（C）mRNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig．1 RT-PCR-amplified products of RSUME （A），HIF-1α（B）and VEGF（C）by agarose gel electrophoresis

表2 RSUME、HIF-1α、VEGF mRNA在高、低級別膠質瘤及正常腦組織中的表達情況Tab．2 Expressions of RSUME，HIF-1α，VEGF mRNA in gliomas and normal brain tissues

2．3 腦膠質瘤組織中 RSUME、HIF-1α、VEGF mRNA表達的相關性 腦膠質瘤組織中RSUME mRNA的表達與 HIF-1αmRNA的表達呈正相關（r＝0．898 3，P＜0．01，圖2A）；腦膠質瘤組織中RSUME mRNA的表達與 VEGF mRNA的表達呈正相關（r＝0．898 3，P＜0．01，圖2B）；腦膠質瘤組織中 HIF-1αmRNA的表達與 VEGF mRNA的表達呈正相關（r＝0．959 9，P＜0．01，圖2C）。

圖2 腦膠質瘤組織中RSUME、HIF-1α、VEGF mRNA的相關性Fig．2 The correlation among the expressions of RSUME mRNA，HIF-1αmRNA and VEGF mRNA in gliomas

2．4 SUMO-1、HIF-1α、VEGF蛋白在膠質瘤組織中的表達 SUMO-1蛋白主要定位于膠質瘤細胞核，HIF-1α蛋白主要定位于膠質瘤細胞核，VEGF蛋白主要定位于膠質瘤胞質和（或）胞膜（圖3）。

2．5 SUMO-1蛋白在膠質瘤組織中的表達 35例高級別膠質瘤（Ⅲ～Ⅳ級）中陽性表達者為100%（35／35），其中高表達為85．71%（30／35），28例低級別膠質瘤（Ⅰ～Ⅱ級）中陽性表達為64．29%（18／28），其中高表達為10．71%（3／28）；對應9例正常腦組織陽性表達者為11．11%（1／9），其中高表達為0（0／9）。正常腦組織、低級別膠質瘤、高級別膠質瘤間SUMO-1的表達有統(tǒng)計學差異（H＝47．081，P＜0．01，表3）。

2．6 HIF-1α在膠質瘤組織中的表達 35例高級別膠質瘤中陽性表達者為94%（33／35），28例低級別膠質瘤中陽性表達為53．57%（15／28），對應9例正常腦組織陽性表達者為0（0／9）。正常腦組織、低級別膠質瘤、高級別膠質瘤間HIF-1α的表達有統(tǒng)計學差異（H＝44．073，P＜0．01，表4）。

2．7 VEGF蛋白在膠質瘤組織中的表達 35例高級別膠質瘤中陽性表達者為91%（32／35），28例低級別膠質瘤中陽性表達為39．29%（11／28），對應9例正常腦組織陽性表達者為0（0／9）。正常腦組織、低級別膠質瘤、高級別膠質瘤間VEGF的表達有統(tǒng)計學差異（H＝41．812，P＜0．01，表5）。

表3 正常腦組織、低級別膠質瘤、高級別膠質瘤SUMO-1蛋白表達強度的比較Tab．3 Expression of SUMO-1protein in human gliomas andnormal brain tissues

2．8 SUMO-1、HIF-1α在腦膠質瘤表達的相關性經(jīng)Spearman相關性分析，SUMO-1與HIF-1α在腦膠質瘤中的表達存在統(tǒng)計學差異（P＜0．01）。兩者呈明顯正相關關系（r＝0．857，表6）。

圖3 SUMO-1、HIF-1α、VEGF在高、低級別膠質瘤組織及正常腦組織中的表達Fig．3 Expressions of SUMO-1，HIF-1αand VEGF protein in human gliomas and normal brain tissues by immunohistochemistry（×400）

2．9 RSUME表達對腦膠質瘤患者預后的影響Kaplan-Meier生存分析顯示，RSUME低表達的膠質瘤患者的無進展生存期（PFS）為16．22月，高表達組PFS為30．19月，Log Rank單變量分析顯示，RSUME低表達患者的PFS明顯長于高表達組（χ2＝36．032，P＜0．01，圖4）。

表4 正常腦組織、低級別膠質瘤、高級別膠質瘤HIF-1α蛋白表達強度的比較Tab．4 Expression of HIF-1αprotein in human gliomas and normal brain tissues

表5 正常腦組織、低級別膠質瘤、高級別膠質瘤VEGF蛋白表達強度的比較Tab．5 Expression of VEGF protein in human gliomas and normal brain tissues

表6 SUMO-1與HIF-1α在腦膠質瘤中表達的關系Tab．6 Correlation between the expressions of SUMO-1and HIF-1αin gliomas

圖4 RSUME的表達水平對腦膠質瘤患者PFS的影響Fig．4 Effects of RSUME expression level on PFS in human gliomas

3 討 論

腦膠質瘤的生長及惡性程度的增加需要足夠的氧氣供應，隨著腫瘤的增長，腫瘤組織會處于缺氧狀態(tài)，缺氧與許多生理和病理過程密切相關。腫瘤的生長、浸潤和轉移過程依賴于血管新生，依靠新生血管來提供營養(yǎng)（包括氧氣）和排泄廢物。在缺乏新生血管的情況下，腫瘤通常在長到幾毫米后由于缺氧而停止生長［14］。細胞對低氧應激的直接反應之一是在細胞內積聚轉錄因子HIF-1，在細胞對環(huán)境條件的應答調節(jié)中發(fā)揮重要作用［15］。同時，HIF-1α也可通過調控下游靶基因，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促進血管新生，血管的生成是腦膠質瘤發(fā)生侵襲的重要機制，VEGF是血管新生和生長的重要因子，其中VEGF的KDR受體能調控新生血管的生成［16-17］、Flk-1受體能增加血管腔化作用進而增加血管通透性［18-19］。本研究證實，在高級別膠質瘤中HIF-1α、VEGF蛋白及mRNA的表達均高于低級別膠質瘤及正常腦組織，提示膠質瘤的惡性程度與HIF-1α／VEGF通路密切相關。

SUMO分為SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3三種蛋白亞型［20］；SUMO化的作用首先需要泛素活化酶E1作用于SUMO-1，形成成熟的SUMO-1蛋白，然后與泛素結合酶E2（Ubc9）結合，最后通過泛素連接酶E3與靶蛋白結合，增強蛋白質底物的穩(wěn)定性及活性［21］。與泛素化作用相反，SUMO并不引起蛋白降解，而是通過翻譯后修飾，保護蛋白免受泛素化降解、影響細胞內的定位和蛋白與蛋白之間的相互作用［22-23］。RSUME是一種可促進蛋白小泛素化作用的基因片段［12］；低氧、CoCl2誘導缺氧及熱休克環(huán)境下可誘導RSUME的表達，poly-A RNA斑點膜的實驗中發(fā)現(xiàn)［10］，RSUME可在多個組織中表達，但在腦組織、心臟、腎臟、肝臟、胃、胰腺、前列腺和脾臟中表達較高。RSUME具有促進腫瘤生成、血管新生的能力［24］。研究發(fā)現(xiàn)［10-11］，RSUME 可通過 SUMO 化促進腫瘤血管新生。RSUME不僅可促進SUMO化中Ubc9和SUMO-1相互的作用，并且還可以編碼RWD結構域蛋白與SUMO化的底物HIF-1α結合形成二聚體，進一步促進底物SUMO化［25］，可與HIF-1α序列中的泛素化位點Lys391和Lys477結合阻斷蛋白質的泛素化-蛋白酶體降解途徑，抑制HIF-1α的降解［26］。并且SHAN等［27］在垂體瘤細胞中證實，在缺氧環(huán)境下敲低RSUME的表達，能夠明顯抑制 HIF-1α的生成，證明 HIF-1α的生成需要RSUME的調控。本研究證實，隨膠質瘤惡性程度增高，RSUME mRNA表達及其SUMO化程度增高，且RSUME與HIF-1α、VEGF的表達呈明顯正相關。提示RSUME可能通過SUMO化的作用穩(wěn)定、提高腦膠質瘤的血管生長因子HIF-1α及其下游基因VEGF，促進腦膠質瘤的增殖、侵襲。同時，RSUME與患者預后指標PFS密切相關，表明RSUME與膠質瘤的惡性程度及復發(fā)情況有關。

綜上所述，人腦膠質瘤中RSUME能通過SUMO化調控HIF-1α／VEGF通路，增加人腦膠質瘤血管新生及腫瘤侵襲。進一步在膠質瘤細胞中調控RSUME的表達，進而觀察膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等情況及驗證其SUMO化與HIF-1α／VEGF的關系是我們進一步研究的重要方向。同時，缺氧誘導RSUME生成的機制有待進一步研究。RSUME作為一個新的腦膠質瘤發(fā)病機制的重要原因，與患者的預后密切相關，其深入的研究有望為膠質瘤的治療提供新的靶點。

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