劉江濤，龐清江，王 云，吳翠艷，郭 雄

（1．寧波市第二醫(yī)院骨科中心，浙江寧波 315010；2．西安交通大學醫(yī)學部公共衛(wèi)生系、教育部環(huán)境與疾病相關(guān)基因重點實驗室，陜西西安 710061）

大骨節(jié)?。↘ashin-Beck disease，KBD）是一種地方性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，主要分布在我國從東北至西南的狹長區(qū)域［1］。本病的病因尚不明確，但在過去150年里提出了50余種相關(guān)危險因素，目前主要集中在三種病因假說：生物地球化學（低硒）假說，糧食真菌毒素污染中毒假說，以及飲用水有機質(zhì)污染假說［2］。大骨節(jié)病的特征性病變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨和生長板軟骨的深層細胞壞死，軟骨基質(zhì)喪失，進而導致繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)病和骨關(guān)節(jié)畸形，嚴重者可致傷殘和勞動能力喪失［3］。成熟軟骨組織中的唯一細胞類型為軟骨細胞，它產(chǎn)生并維持軟骨基質(zhì)，且參與軟骨組織損傷的修復［4］。

線粒體（mitochondrion）在許多細胞活動中發(fā)揮著重要作用，包括產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）為細胞供能，大量中間代謝產(chǎn)物的氧化和細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)等。線粒體還是細胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的場所，同時本身也是氧自由基攻擊的靶標［5］。線粒體功能障礙可引起細胞內(nèi)的多種信號級聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細胞死亡等［6］。

既往研究表明，大骨節(jié)病患者軟骨細胞線粒體損傷［7］，且在糧食真菌毒素和環(huán)境低硒等有害可疑致病因素實驗中，軟骨細胞線粒體損傷的形態(tài)學改變明顯［8］。由于大骨節(jié)病軟骨損傷主要發(fā)生在兒童和青少年中，隨著年齡的增長而關(guān)節(jié)軟骨損傷加重，是否軟骨線粒體功能損傷與年齡有關(guān)尚不明確。本研究重點評估大骨節(jié)病患者關(guān)節(jié)軟骨細胞的線粒體功能及其與年齡的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 DMEM購自Hyclone公司，胎牛血清購自蘭州民海公司，Ⅱ型膠原酶購自Gibco公司，TMRM熒光探針、ATP檢測試劑盒和活性氧檢測試劑盒購自GIBCO／Invitrogen公司。

1．2 軟骨組織和細胞培養(yǎng) 關(guān)節(jié)軟骨組織來自10例大骨節(jié)病患者和8例正常對照。大骨節(jié)病患者是按照大骨節(jié)病診斷標準［7］被診斷為Ⅱ度和Ⅲ度的患者（4女／6男，43歲至60歲），并在接受全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)時取其軟骨。正常膝關(guān)節(jié)軟骨取自死于交通意外的捐獻者新鮮尸體（3女／5男，33歲至62歲）。分離軟骨細胞：PBS沖洗3次，37℃孵育10min。胰蛋白酶處理之后，將軟骨切片置于Ⅱ型膠原酶溶液中37℃孵育12～16h。紗布過濾除去未消化的軟骨碎片，軟骨細胞接種于DMEM培養(yǎng)瓶中，50mL／L CO2培養(yǎng)箱37℃孵育，培養(yǎng)液每周更換2～3次。原代或一代細胞用于所有實驗。錐蟲藍染色評估細胞活力。

1．3 線粒體呼吸鏈復合體活性的測定 用分光光度法測定呼吸鏈復合體活性［9］。將5～40μg的線粒體蛋白加入到終體積為1mL的緩沖液中，分別加入各自的底物后，通過測定340nm波長處還原型煙酰胺腺嘌呤二核 苷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide-reduced，NADH）吸光度值計算復合體Ⅰ活性、600nm處二氯酚靛酚（2，6-dichlorophenolindophenol，DCPIP）吸光度值計算復合體Ⅱ活性、550nm處還原型細胞色素C吸光度值計算復合體Ⅲ活性，550nm處還原型細胞色素C吸光度值計算復合體Ⅳ活性，以及412nm處5-硫-2-硝基苯甲酸［5，5′-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB］吸光度值計算檸檬酸合酶的活性。用檸檬酸合酶活性來標準化線粒體呼吸鏈復合體活性，酶活性單位為nmol／min／mg protein。

1．4 細胞內(nèi)ATP含量的檢測 細胞內(nèi)ATP含量檢測根據(jù)GIBCO／Invitrogen公司的ATP檢測試劑盒說明書操作。離心收集1×106細胞，TD洗細胞一次，懸浮于100μL TE緩沖液。先冰上孵育5min；再100℃沸水煮5min。然后14 000g離心2～3min，留取上清到新的EP管；BCA法測定蛋白濃度。雙蒸水稀釋ATP標準溶液稀釋成適當?shù)臐舛忍荻龋?、0．001、0．01、0．1、1、10μmol／L。加樣品和ATP 標準溶液到ATP檢測標準反應(yīng)混合物。利用Biotek Synergy HT多功能微孔板檢測儀檢測化學發(fā)光，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品中的ATP含量。

1．5 線粒體膜電位的檢測 離心收集1×106細胞，PBS洗滌細胞1次，懸浮細胞于200nmol／L TMRM工作液中，37℃避光孵育15min。PBS洗細胞3次，重新懸浮細胞后轉(zhuǎn)移到不透明黑色96孔板，Biotek Synergy HT多功能微孔板檢測儀于540nm激發(fā)波長檢測熒光變化。以Hoechst 33342作為對照，設(shè)定激發(fā)波長392nm，計算相對線粒體膜電位。

1．6 細胞內(nèi)活性氧的檢測 收集1×106cells／mL密度的細胞，以含10μmol／L DCFH-DA的PBS（pH 7．4）取代培養(yǎng)基，37℃避光孵育1h，流式細胞儀在485nm激發(fā)波長和530nm發(fā)射波長檢測DCFH的熒光強度。結(jié)果以控制熒光強度的百分率表示，熒光強度反映氧化應(yīng)激水平。

1．7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件處理，組間比較采用獨立樣本t檢驗，線粒體功能與年齡相關(guān)性研究采用線性回歸分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2．1 正常和大骨節(jié)病軟骨細胞線粒體呼吸鏈復合體活性的比較 線粒體呼吸鏈復合體活性檢測結(jié)果顯示，與正常人軟骨細胞相比，大骨節(jié)病患者軟骨細胞線粒體復合體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性均顯著下降；相反，檸檬酸合酶活性顯著增加。大骨節(jié)病患者軟骨細胞線粒體蛋白含量和復合體Ⅰ活性雖有下降，但與正常對照相比差異并無統(tǒng)計學意義（表1）。

2．2 線粒體呼吸鏈復合體活性與患者年齡的關(guān)系 線性回歸分析顯示，不論是大骨節(jié)病還是正常對照組，軟骨細胞復合體Ⅰ活性和患者年齡之間沒有相關(guān)性；同時，盡管復合體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性在大骨節(jié)病明顯低于正常對照，但是它們和年齡之間也沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（圖1、表2）。

表1 正常和大骨節(jié)病軟骨細胞線粒體呼吸鏈復合體活性的比較Tab．1 Specific activity of the mitochondrial respiratory chain complexes in normal and KBD chondrocytes（±s）

表1 正常和大骨節(jié)病軟骨細胞線粒體呼吸鏈復合體活性的比較Tab．1 Specific activity of the mitochondrial respiratory chain complexes in normal and KBD chondrocytes（±s）

＊ 線粒體呼吸酶鏈復合體活性用檸檬酸合酶活性校正為：mmol／（min·mg prot）／（檸檬酸合酶活性）×100。

組別 例數(shù) 蛋白量（mg／mL）檸檬酸合酶活性［nmol／（min·mg prot）］線粒體呼吸鏈復合體活性［nmol／（min·mg prot）］＊復合體Ⅰ 復合體Ⅱ 復合體Ⅲ 復合體Ⅳ正常對照 8 2．74±0．49 86．42±15．75 33．67±6．33 12．89±3．22 52．98±6．57 47．20±6．16大骨節(jié)病 10 2．47±0．61 102．26±13．53 29．97±4．79 7．69±2．03 43．90±5．32 38．75±4．81 P值0．33 0．04 0．18 0．001 0．005 0．005

圖1 2組線粒體呼吸鏈復合體活性和年齡的關(guān)系Fig．1 Correlation between activity of mitochondrial respiratory chain complexes and donor age in normal and KBD chondrocytes

表2 2組線粒體呼吸鏈復合體活性和年齡相關(guān)性的P值Tab．2 P-value of correlation between donor age and activity of mitochondrial respiratory chain complexes （P）

2．3 細胞內(nèi)ATP含量的分析 大骨節(jié)病患者軟骨細胞內(nèi)ATP水平（30．68±4．96）比正常軟骨細胞（42．15±7．27）明顯下降，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＝0．001）（圖2）。

2．4 軟骨細胞線粒體膜電位水平 熒光探針TMRM檢測線粒體膜電位結(jié)果顯示，大骨節(jié)病軟骨細胞（1．78±0．39）與正常軟骨細胞（2．72±0．55）相比，線粒體膜電位顯著下降（P＝0．001，圖3）。

圖2 正常對照組和大骨節(jié)病組軟骨細胞內(nèi)ATP含量的比較Fig．2 Cellular ATP content in normal and KBD chondrocytes

2．5 2組線粒體膜電位和年齡的關(guān)系 雖然細胞內(nèi)線粒體膜電位水平隨著年齡的增加而下降，但是回歸分析并未證明二者在大骨節(jié)病患者軟骨細胞（P＝0．36）或正常軟骨細胞（P＝0．25）之間存在著關(guān)聯(lián)性（圖4）。

圖3 正常和大骨節(jié)病軟骨細胞線粒體膜電位水平的比較Fig．3 Mitochondrial membrane potential in normal and KBD chondrocytes

圖4 軟骨細胞線粒體膜電位和年齡的相關(guān)性Fig．4 Correlation between mitochondrial membrane potential and donor age

2．6 細胞內(nèi)活性氧含量的比較 細胞內(nèi)活性氧含量反映了線粒體產(chǎn)生和清除氧自由基的功能，過量的活性氧產(chǎn)生會導致細胞凋亡增加。Carboxy-H2DCFDA熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧，與正常軟骨細胞相比，大骨節(jié)病軟骨細胞內(nèi)的活性氧含量增加了1．2倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．001）（圖5）。

3 討 論

本研究首次證實了成人大骨節(jié)病患者存在軟骨細胞線粒體功能的改變，包括線粒體數(shù)目的增多，線粒體呼吸鏈復合體功能障礙，ATP耗竭，線粒體去極化，以及活性氧含量的增加；線粒體功能與年齡在大骨節(jié)病和正常對照組間均無顯著相關(guān)性。

在氧化磷酸化過程中，線粒體內(nèi)膜上的四個電子傳遞鏈復合體（呼吸鏈復合體Ⅰ～Ⅳ）協(xié)調(diào)作用生成ATP，產(chǎn)生能量。對大骨節(jié)病軟骨細胞線粒體電子傳遞鏈復合體Ⅰ～Ⅳ活性的研究發(fā)現(xiàn)，復合體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性明顯降低，與對照組相比分別降低了40．34%、17．14%和17．90%，電子傳遞鏈功能因此受損。而線粒體電子傳遞鏈功能的下降可能通過以下三種途徑得以補償：①通過增加線粒體數(shù)量，檸檬酸合酶活性增加反映了大骨節(jié)病軟骨細胞線粒體數(shù)目的增多［10］；②通過復合體Ⅰ（NADH 脫氫酶）途徑，有氧呼吸中線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ需要較少的氧消耗［11］，而多元回歸分析證實復合體Ⅰ活性未見明顯降低；③還可能通過增加無氧代謝避免過多活性氧的產(chǎn)生［12］。呼吸鏈復合體活性的下降，會導致細胞內(nèi)ATP含量的減少。實驗證實，大骨節(jié)病軟骨細胞內(nèi)ATP含量比對照組減少27．14%。

圖5 正常對照組和大骨節(jié)病組軟骨細胞內(nèi)活性氧含量的比較Fig．5 Intracellular ROS level in normal and KBD chondrocytes

細胞線粒體膜電位的維持與細胞內(nèi)多種因素有關(guān)。首先，需要線粒體呼吸鏈復合體功能的正常［13］。研究證實，利用線粒體呼吸鏈復合體特異性抑制劑或RNA干擾技術(shù)阻斷呼吸鏈復合體活性，均可導致線粒體膜電位的降低［14］。其次，細胞內(nèi)ATP水平對維持線粒體膜電位也非常重要。細胞內(nèi)ATP和線粒體膜電位相互依存，細胞利用ATP來維持線粒體膜電位，同時ATP的產(chǎn)生也需要線粒體提供正常范圍內(nèi)的膜電位［15］。大骨節(jié)病軟骨細胞呼吸鏈酶復合體活性的降低和ATP含量的減少，最終導致細胞線粒體膜電位的下降。而較低的線粒體膜電位會導致細胞內(nèi)ATP含量和線粒體呼吸鏈復合體功能的進一步下降，形成一種惡性循環(huán)。

在生物體內(nèi)，氧化和抗氧化處于平衡的狀態(tài)，正常情況下的細胞代謝需要線粒體消耗氧來滿足機體的營養(yǎng)和能量需求，進行三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝和生成ATP；另一方面線粒體自身富含的多種酶、結(jié)構(gòu)蛋白、膜脂質(zhì)及核酸等，也是活性氧直接攻擊的目標［16］。線粒體功能的損傷勢必引起細胞氧利用率的降低，從而產(chǎn)生更多的ROS，造成線粒體和細胞內(nèi)氧化損傷的惡性循環(huán)［17］。大骨節(jié)病軟骨細胞活性氧含量比正常對照增加1．2倍，同時線粒體功能明顯受損，說明線粒體功能損傷和氧化應(yīng)激相互作用的不良循環(huán)在大骨節(jié)病的發(fā)病過程中起到重要的作用。

年齡因素被認為是與線粒體功能密切相關(guān)的一個重要指標，線粒體功能通常隨著年齡的增加而降低［18］。但在本研究中，我們并未發(fā)現(xiàn)大骨節(jié)病或正常對照者的線粒體功能與年齡相關(guān)。復合體Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和檸檬酸合酶活性隨年齡的增加而減少，但無統(tǒng)計學意義；相反，復合體Ⅰ活性隨年齡的增加而升高，同樣它和年齡之間也無統(tǒng)計學意義。細胞內(nèi)線粒體膜電位水平隨著年齡的增加而下降，回歸分析也未能證明二者之間在大骨節(jié)病軟骨細胞或正常軟骨細胞存在關(guān)聯(lián)性。這種結(jié)果可能因為以下幾方面的原因：①軟骨細胞中無氧代謝功能代償性增強，掩蓋了部分線粒體功能隨年齡變化的趨勢。②大骨節(jié)病發(fā)病期主要在兒童，到中老年期病情相對平穩(wěn)，線粒體能也趨于穩(wěn)定［19］。③由于軟骨樣本的特殊性，每個年齡段的病例數(shù)有限，未能真實的反映線粒體功能隨年齡變化的趨勢。

總之，線粒體功能障礙參與了大骨節(jié)病的病理生理改變，可能在大骨節(jié)病的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。大骨節(jié)病患者的軟骨細胞線粒體復合體Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性、細胞內(nèi)ATP含量、以及線粒體膜電位的顯著降低。相反，軟骨細胞線粒體數(shù)目卻明顯增多。這可能是機體為維持細胞內(nèi)的ATP產(chǎn)量，代償性升高線粒體量以彌補線粒體氧化磷酸能力的降低。在大骨節(jié)病和正常對照組中，線粒體功能與年齡均無顯著相關(guān)性，說明大骨節(jié)病和軟骨老齡化可能是不同的代謝過程。

［1］中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會．2013年我國衛(wèi)生和計劃生育事業(yè)發(fā)展統(tǒng)計公報［EB］．2014．http：／／www．nhfpc．gov．cn／guihuaxxs／s10742／201405／886f82dafa344c3097f1d16581a1bea2．shtml．

［2］全國大骨節(jié)病監(jiān)測組．2006年全國大骨節(jié)病病情監(jiān)測總結(jié)報告［J］．中國地方病學雜志，2006，25（6）：670-672．

［3］GUO X，MA WJ，ZHANG F，et al．Recent advances in the research of an endemic osteochondropathy in China：Kashin-Beck disease［J］．Osteoarthr Cartilage，2014，22（11）：1774-1783．

［4］MERA H，ITOKAZU M，WAKITANI S．Cartilage repair and regenerative medicine：past，present，and future［J］．Clin Calcium，2013，23（12）：1715-1722．

［5］VENDITTI P，DI STEFANO L，DI MEO S．Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species［J］．Mitochondrion，2013，13（2）：71-82．

［6］BRAND MD，NICHOLLS DG．Assessing mitochondrial dysfunction in cells［J］．Biochem J，2011，435（2）：297-312．

［7］LIU JT，GUO X，MA WJ，et al．Mitochondrial function is altered in articular chondrocytes of an endemic osteoarthritis，Kashin-Beck disease［J］．Osteoarthr Cartilage，2010，18（9）：1218-1226．

［8］YAN D，KANG P，YANG J，et al．The effect of Kashin-Beck disease-affected feed and T-2 toxin on the bone development of Wistar rats［J］．Int J Rheum Dis，2010，13（3）：266-272．

［9］MANEIRO E，MARTIN MA，DE ANDRES MC，et al．Mitochondrial respiratory activity is altered in osteoarthritic human articular chondrocytes［J］．Arthritis Rheum，2003，48（3）：700-708．

［10］CILLERO-PASTOR B，MARTIN MA，ARENAS J，et al．Effect of nitric oxide on mitochondrial activity of human synovial cells［J］．BMC Musculoskelet Disord，2011，12：42．

［11］SHARMA LK，LU J，BAI Y．Mitochondrial respiratory complex I：structure，function and implication in human diseases［J］．Curr Med Chem，2009，16（10）：1266-1277．

［12］ALMEIDA A，ALMEIDA J，BOLANOS JP，et al．Different responses of astrocytes and neurons to nitric oxide：the role of glycolytically generated ATP in astrocyte protection［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2001，98：15294-15299．

［13］JOHNSON K，JUNG A，MURPHY A，et al．Mitochondrial oxidative phosphorylation is a downstream regulator of nitric oxide effects on chondrocyte matrix synthesis and mineralization［J］．Arthritis Rheum，2000，43（7）：1560-1570．

［14］LOPEZ-ARMADA MJ，CARAMES B，MARTIN MA，et al．Mitochondrial activity is modulated by TNFa and IL-1beta in normal human chondrocyte cells［J］．Osteoarthr Cartilage，2006，14（10）：1011-1022．

［15］BRAND MD，NICHOLLS DG．Assessing mitochondrial dysfunction in cells［J］．Biochem J，2011，435（2）：297-312．

［16］RABILLOUD T，HELLER M，RIGOBELLO MP，et al．The mitochondrial antioxidant defence system and its response to oxidative stress［J］．Proteomics，2001，1（9）：1105-1110．

［17］ZOROV DB，JUHASZOVA M，SOLLOTT SJ．Mitochondrial reactive oxygen species（ROS）and ROS-induced ROS release［J］．Physiol Rev，2014，94（3）：909-950．

［18］GREEN DR，GALLUZZI L，KROEMER G．Mitochondria and the autophagy-inflammation-cell death axis in organismal aging［J］．Science，2011，333（6046）：1109-1112．

［19］FANG H，GUO X，F(xiàn)AROOQ U，et al．Development and validation of a quality of life instrument for Kashin-Beck disease：an endemic osteoarthritis in China［J］．Osteoarthr Cartilage，2012，20（7）：630-637．