孫雷濤，宋錦寧，杜洪澎，王曉紅，李 勐，李澤福

（1．濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科、實驗中心，山東濱州 256600；2．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061）

遲 發(fā) 性 腦 血 管 痙 攣 （delayed cerebral vasospasm，DCVS）由ECKER首次提出以來，DCVS引起的缺血性腦損傷是影響SAH患者預(yù)后的主要因素之一［1-2］。目前，大量研究表明，DCVS與內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）有 關(guān)［3-4］。ET-1 通 過 ETA／ETB兩種不同受體動態(tài)地調(diào)節(jié)著血管緊張度［5］。本研究通過建立SAH后腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）模型，動態(tài)觀察了ETA／ETB兩種不同受體與CVS發(fā)生的關(guān)系，旨在闡明內(nèi)皮素受體不平衡表達(dá)在CVS中的作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠60只（西安交通大學(xué)實驗動物中心），體質(zhì)量240～260g，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫（24±2）℃，24h晝夜循環(huán)光照，術(shù)前術(shù)后自由攝食飲水。動物隨機分為SAH模型組、鹽水對照組、假手術(shù)對照組（6只）、正常對照組（6只）。SAH模型組、鹽水對照組根據(jù)建立模型后的不同時間段分為4個亞組，分別是：建模后的2d組、3d組、7d組和14d組。每個亞組6只動物。

1．2 大鼠SAH模型制作及標(biāo)本取材 大鼠自體血二次注入枕大池SAH模型制作參照PRUNELL等［6］實驗方法，應(yīng)用100g／L水合氯醛（3．5mL／kg）腹腔麻醉后取俯臥頭低位，在手術(shù)顯微鏡下暴露寰枕筋膜，尾動脈取血0．4mL，用4號頭皮針緩慢進(jìn)針刺破寰枕筋膜，至清亮腦脊液（CSF）流出，將未抗凝自體血0．3mL緩慢注入（用時20min）枕大池，注射后穿刺點壓迫5min，耳腦膠封閉穿刺點并保持頭低位30min以上。48h后依上法二次操作，建立SAH的DCVS模型。正常對照組不進(jìn)行任何手術(shù)操作。鹽水對照組建立方法同SAH組，但注入等量的37℃生理鹽水。穿刺對照組僅行枕大池穿刺并見到CSF流出，48h后進(jìn)行第二次穿刺。時間按第2次注血造模成功后開始計算。

各組動物達(dá)到預(yù)定時間后取材，動物麻醉后，37℃、250mL的生理鹽水重力作用下沿大鼠體循環(huán)快速灌注，而后用40g／L多聚甲醛溶液400mL進(jìn)行免疫熒光行灌注固定。迅速斷頭取腦，在橋腦中央處橫斷，取保留基底動脈上段的腦片。行常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后冠狀切片，片厚約7μm，每個標(biāo)本常規(guī)切7層，兩層用于染色，剩余應(yīng)用于血管截面積計算。

1．3 形態(tài)學(xué)觀察 切片在常規(guī)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察基底動脈形態(tài)學(xué)變化，并應(yīng)用圖像采集與分析系統(tǒng)（Q550W，Leica公司，德國）收集數(shù)據(jù)。計算每只動物基底動脈3層切片截面積，求均值。

1．4 免疫熒光染色 應(yīng)用兔抗鼠ETA／ETB受體（ETAR／ETBR）單克隆一抗及羊抗兔熒光二抗（博士德公司）行免疫熒光染色。切片置于OLYMPUS（IX71-A21PH，日本）熒光顯微鏡400倍下照相并應(yīng)用Image-ProPlus圖像分析軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)化灰度分析。

1．5 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。先行方差齊性檢驗，方差齊的指標(biāo)采用One-way ANOVA檢驗的方差分析，并行LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，方差不齊的指標(biāo)則用Kruskal-Wallis法行秩和檢驗。計量資料的結(jié)果采用Mean＋SEM表示，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 基底動脈的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 SAH實驗組造模后2d血管內(nèi)皮細(xì)胞即出現(xiàn)褶皺，血管平滑肌收縮，血管平滑肌層厚度增大，基底動脈截面積較鹽水對照組出現(xiàn)顯著下降（P＜0．05），3d時狹窄到達(dá)最高峰，在7d以后直到14d時血管直徑逐漸恢復(fù)正常。在注血手術(shù)后，大鼠基底動脈出現(xiàn)了明顯規(guī)律性腦血管收縮（圖1）。

圖1 大鼠造模后基底動脈面積的動態(tài)變化Fig．1 Dynamic changes of the area of the basilar artery after CVS

2．2 SAH后基底動脈ETA／ETB受體免疫熒光染色及半定量分析 免疫熒光染色結(jié)果顯示，正常、假手術(shù)組、鹽水對照組可見ETA／ETB受體蛋白較弱表達(dá)。SAH后2d基底動脈ETA受體已有增強，3d達(dá)高峰，此后逐漸減弱，主要集中在血管內(nèi)皮層；而ETBR在7d達(dá)高峰，此后熒光強度逐漸減弱，3d時在內(nèi)皮細(xì)胞層熒光強度升高表現(xiàn)的更加明顯，而7、14d時血管平滑肌中熒光強度升高較明顯（圖2）。熒光灰度分析顯示總熒光強度ETAR最高峰出現(xiàn)在第3天，而ETBR出現(xiàn)在第7天。SAH后2、3、7、14d時ET受體表達(dá)與正常對照組相應(yīng)時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。ETB受體在SAH實驗組中2～3d時在內(nèi)皮細(xì)胞層中表達(dá)增強更明顯，而在7d時平滑肌細(xì)胞層中的表達(dá)增強更明顯（圖3）。

圖2 大鼠基底動脈ET受體免疫熒光染色結(jié)果Fig．2 Immunofluorescence staining results of ET receptor in the rat basilar artery

圖3 大鼠基底動脈內(nèi)皮細(xì)胞層與平滑肌細(xì)胞層中ETBR受體免疫熒光灰度值的表達(dá)變化Fig．3 Changes of immunofluorescence gray value of ETBR in the endothelial and smooth muscle cells of rat basilar artery

3 討 論

30年來對DCVS的研究，比較公認(rèn)可能是多種因素共同作用的結(jié)果，血管舒縮因子的不平衡在其中起重要作用［7-8］。ET-1與ETA受體結(jié)合后會激活磷脂酶C，進(jìn)而使Ca2＋內(nèi)流和PKC激活，此時磷脂酶A2和D也被激活使甘油二脂（DAG）持續(xù)升高，后者又是PKC的內(nèi)源性激動劑。與存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的ETB1受體結(jié)合，發(fā)揮血管依賴性松弛作用，而與存在于血管平滑肌細(xì)胞的ETB2受體結(jié)合，發(fā)揮與ETA受體相同的縮血管效應(yīng)。但對于ET-1的血管收縮信號機制仍不十分清楚［9］。

本研究在公認(rèn)的Delgado法大鼠枕大池穿刺二次注血法建立大鼠的CVS模型基礎(chǔ)上，改進(jìn)傳統(tǒng)的股動脈或股靜脈血注入。選用大鼠尾動脈血注入，以最大限度減少手術(shù)并發(fā)癥及動物死亡率［10-11］。從基底動脈形態(tài)學(xué)觀察可以看出造模后在3～7d時發(fā)生了明顯的血管痙攣，與臨床發(fā)生DCVS的時程一致。此方法可以定量、定時、定部位的注血并良好模擬了DCVS的病理過程。同時，本研究中取材采用了37℃生理鹽水心臟灌注及快速取腦液氮保存的方法，使得腦灌注壓盡量保持與正常血壓一致，而且很好阻滯了腦血管發(fā)生快速血壓調(diào)節(jié)引起的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)換。但是，目前的實驗技術(shù)及生化試劑限制，仍存在不能很好區(qū)分ETB受體的亞型表達(dá)改變、表達(dá)部位的準(zhǔn)確定位、很難對表達(dá)蛋白進(jìn)行定量檢測等問題。

本實驗結(jié)果顯示大鼠SAH后DCVS模型中基底動脈內(nèi)皮細(xì)胞中ETA／ETB受體均有表達(dá)升高，而更為重要的是在SAH后7d時血管平滑肌中ETB受體的表達(dá)達(dá)到高峰。分析其原因可能與SAH后CVS的緩解有關(guān)，而內(nèi)皮細(xì)胞的ETB受體短暫表達(dá)上調(diào)，可能與ETA受體共同參與了DCVS的過程。HANSEN等［12］研究發(fā)現(xiàn)SAH后大腦中動脈、基底動脈ETB受體表達(dá)升高而ETA受體沒有變化，后交通動脈兩者均無變化。而ANSAR等［13］研究了不同血管對ET-1反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)在離體培養(yǎng)條件下僅有ETB受體的表達(dá)上調(diào)。而也有類似研究發(fā)現(xiàn)DCVS時ETB受體的表達(dá)下調(diào)，并提出應(yīng)用ETB受體阻滯劑不能很好緩解腦血管收縮［14-15］。分析這種ET受體表達(dá)的不同結(jié)果，我們認(rèn)為可能是由于離體條件下血管灌注壓的瞬時改變，引起了血管收縮性受體的表達(dá)調(diào)節(jié)變化以及與腦血管取材方法、取材時間有關(guān)。因此，對于ET受體表達(dá)的研究應(yīng)該更加注重體內(nèi)研究以及取材前的腦灌注壓維持。本實驗結(jié)果顯示，SAH后3～7d時發(fā)生了明顯基底動脈的血管收縮；ET受體的蛋白及mRNA水平的表達(dá)表現(xiàn)一致。內(nèi)皮細(xì)胞中ETA受體與ETB受體3d時表達(dá)顯著升高可能參與了DCVS的發(fā)生，而血管平滑肌中ETB受體7d時的表達(dá)升高，可能與7d后DCVS的緩解有關(guān)聯(lián)；ETB受體兩種亞型的差異性表達(dá)可能是DCVS中的原因。

ET-1在DCVS的作用機制復(fù)雜。本研究結(jié)果表明兩種ETA／ETB受體的差異性表達(dá)在SAH后CVS中起重要作用。ETB受體亞型在腦血管各層中具體表達(dá)差異有待進(jìn)一步研究。但本研究結(jié)果提示，深入研究CVS中ET受體下游調(diào)控的具體分子機制和有關(guān)下游各種蛋白激酶表達(dá)變化，及其與ET受體表達(dá)上調(diào)的關(guān)系，可以采用活體免疫熒光自顯影、基因干擾或敲除、高特異性單克隆抗體等蛋白工程與基因工程技術(shù)進(jìn)一步探討。

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