王瑞璇　馬李杰　段鴻濤

王力彬3　金發(fā)光1

活性氧介導(dǎo)的線粒體功能不全與小細胞肺癌多藥耐藥細胞H446/CDDP對順鉑耐藥性關(guān)系的研究

王瑞璇1馬李杰1段鴻濤2

王力彬3金發(fā)光1

肺癌是全球癌癥死亡的首要原因[1-2]，可分為非小細胞肺癌(non small-cell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)。其中，SCLC占肺癌的15%，與NSCLC相比，SCLC惡性程度高， 易發(fā)生早期廣泛性轉(zhuǎn)移，目前治療方案以全身化療為主。順鉑作為治療SCLC的一線化療藥物，其抗腫瘤毒性與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)，且其對 H446細胞凋亡的誘導(dǎo)呈時間和濃度依賴性[3-4]，雖然早期化療緩解率高，但復(fù)發(fā)率較高，且復(fù)發(fā)后可產(chǎn)生獲得性多藥耐藥((multi-drug resistance, MDR)，是目前治療SCLC亟需解決的問題之一。近期有研究表明順鉑耐藥性的發(fā)生可能與細胞凋亡通路的改變密切相關(guān)[5]。在對淋巴瘤的研究中，Sarah等[6]認為淋巴瘤細胞對氧化應(yīng)激的耐受可使細胞發(fā)生凋亡耐受進而產(chǎn)生化療藥物耐藥。課題前期的實驗結(jié)果證實，受順鉑沖擊后，人小細胞肺癌H446細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平明高于其多藥耐藥株H446/CDDP細胞[7]。但氧化應(yīng)激是否通過調(diào)節(jié)凋亡通路進而誘導(dǎo)小細胞肺癌產(chǎn)生順鉑耐藥性以及其具體作用機制還有待進一步探索。

機體在正常情況下，氧化產(chǎn)物 ROS的生成和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài) 。當(dāng)機體受到各種刺激時，此種平衡可被打破，ROS 生成增多且超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，機體可發(fā)生氧化應(yīng)激[8]。機體氧化應(yīng)激不僅參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展， 且其所介導(dǎo)的細胞凋亡途徑的改變可促使腫瘤細胞對化療藥物的敏感性發(fā)生改變。細胞內(nèi)80%的ROS來源于線粒體[9]。細胞內(nèi)增加的ROS可直接或間接損傷線粒體膜，造成線粒體膜電位下降，這一過程又可影響細胞氧化磷酸化，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生進一步增加，形成惡性循環(huán)。細胞內(nèi)ROS水平的增加和線粒體跨膜電位的下降被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中的早期事件[10-11]。 大量研究證實，抗腫瘤藥物可通過增加細胞內(nèi) ROS含量進而導(dǎo)致線粒體功能不全如線粒體膜電位的去極化從而誘導(dǎo)瘤細胞凋亡[12-13]。但是目前鮮有文獻報道細胞內(nèi)ROS含量以及線粒體跨膜電位水平的改變與人小細胞肺癌細胞對順鉑耐藥性的關(guān)系。本實驗中我們通過體外檢測人小細胞肺癌細胞 H446與其多藥耐藥細胞H446/CDDP在5 μg/ml順鉑作用下的生存率、凋亡百分比、細胞內(nèi)ROS的含量以及線粒體膜電位水平，旨在探討細胞內(nèi)ROS的含量以及線粒體功能不全與小細胞肺癌多藥耐藥細胞H446/CDDP對順鉑耐藥性的關(guān)系及其相關(guān)作用機制。

材料與方法

一、材料與試劑

人小細胞肺癌細胞株 H446及其多藥耐藥細胞H446/CDDP由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍呼吸科研究所饋贈。RPMI-1640培養(yǎng)基以及胎牛血清于Gibco公司購買，Annexin V-FITC/PI(Propid-iumiodide，碘化丙啶)雙染色法凋亡檢測試劑盒購自美國B-D pharmingen公司, MTT, JC-1膜電位試劑盒，活性氧檢測試劑均購于碧云天生物有限公司。其他所需材料還包括 0.25%胰酶, DMSO, PBS,酶標(biāo)測試儀，96孔和6孔細胞培養(yǎng)板等。

二、實驗方法

1. 細胞培養(yǎng): 人肺癌細胞H446和其多藥耐藥細胞H446/CDDP分別應(yīng)用不包含和包含順鉑(終濃度為0.5 μg/ml)的完全培養(yǎng)基RPMI-1640，內(nèi)含10%胎牛血清培養(yǎng)，其中青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml，置37 ℃，5%CO2，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2. MTT法測定細胞生存率: 取對數(shù)生長期的H446和H446/CDDP兩種細胞，0.25%胰酶消化，培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液，分別取200 μl細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板之中，保證每孔的細胞接種量為5×103個，然后將96孔板置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后，吸去培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)基，空白對照組加入200 μl完全培養(yǎng)基，加藥組加入含順鉑 (終濃度為5 μg/ml)的培養(yǎng)基200 μl，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml，PBS配制)，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h之后，吸去每孔上清液，加入150 μl DMSO，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm處檢測各孔的OD值，重復(fù)3次。計算細胞的存活率。細胞存活率=(用藥組OD-空白組OD值)/(對照組OD-空白組OD值)×100%。

3. Annexin V/PI雙染色測定細胞凋亡: 取對數(shù)生長期的H446和H446/CDDP兩種細胞，0.25%胰酶消化，培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液，以1×105/孔分別接種于兩個六孔培養(yǎng)板中，置37 ℃ ，含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細胞生長至六孔板底面積的60～70%時，吸去培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)基，空白對照組加入2 ml完全培養(yǎng)基，加藥組加入含5 μg/ml順鉑的培養(yǎng)基2 ml，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰酶消化細胞，離心半徑8 cm，800 r/min，離心5 min棄上清液收集細胞；每管中加入2 ml PBS液混勻，細胞離心洗滌2次。最后加入300 μl Binding Buffer重懸細胞，再加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl PI，避光室溫反應(yīng)15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

4. 細胞內(nèi)ROS的檢測: 取對數(shù)生長期的H446和H446/CDDP細胞，以1×105/孔分別接種于兩個六孔培養(yǎng)板中，兩種細胞均分為陰性對照組, 加藥組(加入5 μg/ml的順鉑),分別檢測順鉑刺激24 h后，兩種細胞內(nèi)ROS的變化。用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞一次，每孔加入2 ml終濃度為10 μmol/L DCFH-DA 的無血清培養(yǎng)基充分覆蓋細胞，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，充分去除未進入細胞的DCFH-DA，最后加入1 ml無血清培養(yǎng)基，30 min內(nèi)置于熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光的強弱代表細胞內(nèi)ROS的水平。

5. JC-1測線粒體膜電位(MMP): JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(MMP) 的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。取對數(shù)生長期的H446和H446/CDDP細胞，0.25%胰酶消化，培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液，以1×105/孔分別接種于六孔培養(yǎng)板中，兩種細胞均分為陰性對照組，加藥組(加入5 μg/ml的順鉑)，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h， 然后進行線粒體膜電位的檢測，首先吸去六孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞兩次，每孔加入1 ml細胞培養(yǎng)液、1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后,吸除上清液，用1×JC-1緩沖液洗滌細胞兩次，最后每孔加入2 ml細胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察。檢測JC-1單體即綠色熒光時，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為530 nm，檢測JC-1復(fù)合物即紅色熒光時，激發(fā)波長為525 nm，發(fā)射波長為590 nm。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩樣本均數(shù)比較用t檢驗；多個樣本均數(shù)比較用單因素方差分析 。P≤0.05即差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、順鉑對H446和H446/CDDP兩種細胞的生長抑制

應(yīng)用5 μg/ml的順鉑作用于兩種細胞，如圖1所示，細胞存活率隨時間的延長而降低，呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性。且多藥耐藥細胞H446/CDDP 在24、48、72 h的存活率分別為：0.661±0.023、0.507±0.031和0.441±0.023，明顯高于H446細胞在順鉑刺激時相應(yīng)時間點的存活率：0.389±0.051、0.212±0.020 和0.138±0.009(P<0.05)。

圖1H446和H446/CDDP兩種細胞5 μg/ml順鉑誘導(dǎo)后24、48、72 h后細胞生存率

二、順鉑誘導(dǎo)H446和H446/CDDP細胞凋亡

應(yīng)用5 μg/ml順鉑作用于H446和H446/CDDP兩種細胞24 h后，分別檢測細胞的凋亡百分比。如圖2所示 ，H446細胞和H446/CDDP細胞的凋亡百分比分別為(13.83±1.79)%% 和(4.87±0.80)%，前者明顯高于后者，且H446細胞早期凋亡百分數(shù) 也明顯高于H446/CDDP細胞， 統(tǒng)計學(xué)差異明顯(P<0.05)[(8.63±0.45)%vs. (1.97±0.42)%]。

圖2流式細胞儀檢測細胞凋亡，A：H446正常組，B：H446 5 μg/ml順鉑組，C： H446/CDDP正常組，D：H446/CDDP H446 5 μg/ml順鉑組

三、順鉑誘導(dǎo)H446和H446/CDDP兩種細胞后細胞內(nèi)ROS的含量變化

應(yīng)用5 μg/ml的順鉑作用于兩種細胞24 h后，檢測細胞內(nèi)ROS的含量以明確兩種細胞在順鉑刺激后細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。結(jié)果如圖3所示，H446細胞內(nèi)ROS的水平在順鉑刺激24 h后明顯增加，而H446/CDDP細胞在順鉑刺激24 h后細胞內(nèi)ROS的表達量也有所增加，但增加的程度明顯低于H446細胞。

圖3順鉑誘導(dǎo)24 h后H446和H446/CDDP細胞內(nèi)ROS的水平

四、順鉑誘導(dǎo)H446和H446/CDDP兩種細胞 MMP的檢測結(jié)果

細胞內(nèi)ROS的升高可誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，下降的膜電位又可進一步使細胞內(nèi)ROS增加，兩者協(xié)同作用，是細胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。如圖4所示， 應(yīng)用5 μg/ml的順鉑作用于24 h后，H446細胞內(nèi)紅色熒光減弱，綠色熒光明顯增強，MMP下降水平顯著，而H446/CDDP細胞線粒體內(nèi)紅色熒光強度明顯高于綠色熒光強度，MMP下降水平明顯低于H446細胞。

討論

肺癌作為最常見的惡性腫瘤之一，治療方式包括手術(shù)，放療以及化療等。 SCLC占肺癌的15%左右，因多數(shù)患者在確診早期已發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移，使化療成為治療SCLC的主要手段。但由于多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生，常導(dǎo)致化療的失敗，患者的5年生存率低于5%[14]。因此，深入研究SCLC耐藥性的發(fā)生機制對于提高肺癌患者的總體生存率具有重要的意義。

細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。細胞凋亡有兩種途徑，死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑以及線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑。大量文獻報道，適時適度的細胞凋亡對于機體正常功能的維持具有重要的意義，凋亡耐受不僅是腫瘤細胞的標(biāo)志之一，而且可以誘導(dǎo)腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。在實驗中，我們首先將5 μg/ml的順鉑作用于H446和H446/CDDP兩種細胞，發(fā)現(xiàn)細胞均呈現(xiàn)出時間依賴性的生存抑制，且耐藥細胞的生存率明顯高于敏感細胞，隨著藥物作用時間的延長其耐藥性越來越顯著。順鉑作為化療藥物之一，可以與細胞內(nèi)DNA 結(jié)合形成順鉑-DNA復(fù)合物，從而激活多種信號通路，誘導(dǎo)細胞凋亡進而發(fā)揮毒性作用。因此我們推測H446/CDDP細胞對順鉑的耐藥性與其凋亡耐受相關(guān)。本實驗中，應(yīng)用流式細胞凋亡檢測儀我們發(fā)現(xiàn)兩種細胞在5 μg/ml順鉑作用24 h后，H446細胞和H446/CDDP細胞的凋亡百分比分別為(13.83 ±1.79)%% 和(4.87±0.80)%，前者明顯高于后者，其中早期凋亡細胞比例分別為(8.63±0.45)%和(1.97±0.42)%，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。 提示多藥耐藥細胞H446/CDDP對順鉑耐藥性的產(chǎn)生與凋亡抑制有關(guān)。

圖45 μg/ml順鉑誘導(dǎo)24 h后H446和H446/CDDP兩種細胞線粒體膜電位(MMP)

線粒體是普遍存在于真核細胞中的一種半自主細胞器，除了為細胞供能外，還參與信息傳遞，細胞凋亡等過程，且其基因的突變或者蛋白表達的異常與腫瘤細胞化療藥物耐藥有關(guān)[15-16]。Kachadourian等[17]認為，順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡與細胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)，且以往有文獻報道， H446 細胞內(nèi)ROS含量增加可導(dǎo)致MMP降低，下降的膜電位又可促使線粒體細胞色素C釋放并激活凋亡通路下游相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑的活化，促使小細胞肺癌H446細胞凋亡[18]。本實驗中我們應(yīng)用5 μg/ml的順鉑分別作用于H446和H446/CDDP兩種細胞24 h后，發(fā)現(xiàn)H446細胞內(nèi)ROS的含量明顯高于H446/CDDP細胞內(nèi)ROS的含量 ；與此同時，H446細胞MMP的下降明顯高于H446/CDDP細胞，早期細胞凋亡百分比也相應(yīng)增加 。以上結(jié)果提示H446/CDDP對順鉑耐藥的產(chǎn)生可能與細胞內(nèi)ROS的減少進而導(dǎo)致MMP下降抑制所介導(dǎo)的內(nèi)源性的凋亡耐受有關(guān)。

本研究證實，應(yīng)用順鉑治療小細胞肺癌H446細胞，細胞內(nèi)ROS含量增加，MMP下降，誘導(dǎo)細胞凋亡；而多藥耐藥細胞H446/CDDP對順鉑耐藥性的產(chǎn)生與細胞內(nèi)ROS的含量減少進而導(dǎo)致MMP下降抑制所致的線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性的凋亡耐受有關(guān)。但是具體分子機制還需進一步研究探索，這將為臨床治療小細胞肺癌患者， 提高其總體生存率奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯：王亞南)

王瑞璇，馬李杰，段鴻濤，等. 活性氧介導(dǎo)的線粒體功能不全與小細胞肺癌多藥耐藥細胞H446/CDDP對順鉑耐藥性關(guān)系的研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(5)： 569-573.

·論著·

【摘要】目的探討人小細胞肺癌多藥耐藥細胞 H446/CDDP細胞內(nèi)活性氧(ROS)介導(dǎo)的線粒體功能不全及其與順鉑耐藥性之間的關(guān)系。方法用MTT法檢測H446細胞及其多藥耐藥細胞H446/CDDP在5 μg/ml順鉑作用后的細胞生存率，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，熒光顯微鏡觀察順鉑誘導(dǎo)后兩種細胞內(nèi) ROS含量以及線粒體膜電位 (MMP)水平。實驗中均設(shè)置空白對照組。結(jié)果順鉑誘導(dǎo)后細胞的生存率均隨藥物作用時間的延長明顯降低，且H446/CDDP細胞在各個時間點的生存率均明顯高于H446細胞；5 μg/ml順鉑作用24 h后H446和H446/CDDP兩種細胞的早期凋亡百分比分別為(8.63±0.45)%和(1.97±0.42)%，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；H446細胞內(nèi)ROS的水平在順鉑誘導(dǎo)24 h后明顯升高， 而 H446/CDDP細胞內(nèi)ROS的水平無明顯變化；與此同時，H446細胞 MMP下降水平明顯高于H446/CDDP細胞。結(jié)論順鉑可使小細胞肺癌 H446 細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生增加，MMP下降，從而誘導(dǎo)細胞凋亡，而多藥耐藥細胞H446/CDDP順鉑耐藥性的產(chǎn)生與順鉑作用后細胞內(nèi)ROS減少，MMP下降抑制所致的線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細胞凋亡途徑耐受有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】小細胞肺癌；H446/CDDP細胞；順鉑；細胞凋亡；活性氧

Study of reactive oxygen species mediated mitochondrial dysfunction on cisplatin resistance in multi-drug resistance cells H446/CDDPWangRuiXuan1,MaLiJie1,DuanHongtao2,WangLibin3,JinFaguang1.1DepartmentofRespiratoryMedicine,TangduHospitalaffiliatedtotheForthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China

Correspondingauthor：JinFaguang,Email：jinfag@fmmu.edu.cn

【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between reactive oxygen species-dependent mitochondrial dysfunction and cisplatin resistance in multi-drug resistance cells H446/CDDP. MethodsThe survival rate of small cell lung cancer cells H446 and the multi-drug resistance H446/CDDP cells were measured by MTT assay after cisplatin induced (5 μg/ml). Cell apoptosis were detected by flow cytometry. Meanwhile both Intracellular reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential (MMP)were observed using fluorescence microscope. There were blank controls in the study. ResultThe survival rate of both cells were obviously decreased after cisplatin induced as stimulating time prolonged, and at each time point H446/CDDP cells survival rate were significantly higher than that of H446 cells. Early apoptosis percentage of H446 and H446/CDDP after cisplatin induced(5 μg/ml) were(8.63±0.45)% and (1.97±0.42)%, the difference is statistically significant(P<0.05). ROS content in H446 cells increased markly after being stimulated 24 h by cisplatin, on the other hand ROS in H446/CDDP cells barely rose. At the same time, reduction of the H446 cells MMP was significantly higher than that of H446/CDDP cells. Conclusion Cisplatin induced apoptosis involves increased production of ROS, and dissipation of MMP, while cisplatin resistance in multi-drug resistance cells H446/CDDP is associated with resistance of mitochondriamediated apoptotic (intrinsic) pathways which is mediated by the reduction of intracellular ROS and the inhibition of loss of MMP after the application of cisplatin.

【Key words】Small cell lung cancer;H446/CDDP cells;Cisplatin;Cell apoptosis;Reactive oxygen species (ROS)

收稿日期：(2015-07-09)

文獻標(biāo)識碼：中圖法分類號： R743.2，R563 A

通訊作者：金發(fā)光，Email： jinfag@fmmu.edu.cn

基金項目：作者單位： 710038 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸內(nèi)科1、胸外科2;710038 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系3

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.05.008