汪明志 汪映宇 陳蓉 張超 張華鋒 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所 ，江蘇 蘇州 215104）

RP-HPLC同時(shí)測定維生素片中8種食用合成著色劑含量

汪明志 汪映宇 陳蓉 張超 張華鋒 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所 ，江蘇 蘇州 215104）

目的：建立反相高效液相色譜法同時(shí)測定維生素片中8種合成著色劑的方法。方法：色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，7μm)，流動相為甲醇-0.02 mol/L乙酸銨，梯度洗脫，檢測波長為254 nm。結(jié)果：8種著色劑在0.050～1.037μg/m L范圍內(nèi)峰面積和濃度線性關(guān)系良好（r＞0.999），平均回收率為94.09%～100.34%。結(jié)論：該方法穩(wěn)定，靈敏度高，方便，快速，可以作為檢測維生素片中合成著色劑的方法。

反相高效液相色譜；食用合成著色劑；維生素片；含量

維生素是維持機(jī)體正常代謝和身體健康必不可少的重要物質(zhì)，是構(gòu)成多種輔酶和激素的重要成分，缺乏時(shí)可導(dǎo)致代謝障礙，引發(fā)多種疾病。維生素片含有多種維生素，可以預(yù)防和治療維生素缺乏所引發(fā)的多種疾病。維生素片多為包衣片，包衣可以掩蓋片劑不良?xì)馕丁p少環(huán)境因素對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響、增加適用性、美化外觀等。隨著市場的激烈競爭，為了吸引消費(fèi)者，生產(chǎn)商在包衣材料中加入各種不同顏色的著色劑。著色劑有天然著色劑和合成著色劑之分，由于天然著色劑價(jià)格高，性質(zhì)不穩(wěn)定，而合成著色劑性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)格低廉，所以市場中片劑包衣所用著色劑多為合成著色劑。然而，人工合成著色劑多以化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成，含有一定的有害物質(zhì)，影響人體正常新陳代謝、細(xì)胞活性、甚至引起癌變。所以，對維生素片包衣中合成著色劑進(jìn)行研究和分析，對保障人民健康具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）快速檢測維生素包衣片中常見8種食用合成著色劑含量，為控制和監(jiān)督維生素包衣片中合成著色劑使用提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，2996PDA檢測器，真空泵，G3垂熔漏斗，恒溫水浴鍋，pH計(jì)。

1.2 材料

檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)（純度分別為90.0%，87.0%，93.1%，70.0%，89.0%，88.0%，85.0%，91.0%，來源：Dr. Ehrenstorfer），聚酰胺粉（100目），甲醇（色譜純），檸檬酸，甲酸，乙醇，氨水，乙酸均為分析純，超純水。樣品：TCBJ多種維生素片、HJDD多種維生素片、FYD維生素片、KMS維生素片、ALD維生素片（均來自市場監(jiān)督抽樣）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，7μm），檢測波長：254 nm，柱溫：35℃，流速：1.0 m L/min，進(jìn)樣量：10μL，流動相：甲醇（A）-0.02 mol/L乙酸銨（B），梯度洗脫，5 m in，A：5%，B：95%；5～10 m in，A：5%→15%，B：95%→85%；10～ 20 m in，A：15%→20%，B：85%→80%；20～ 25 m in，A：20%→65%，B：80%→35%；25～ 27 m in，A：65%，B：35%；27～ 32 m in，A：65%→95%，B：35%→5%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取按其純度折算成100%質(zhì)量的檸檬黃22.36 mg，日落黃23.77 mg，莧菜紅22.11 mg，胭脂紅29.37 mg，新紅23.03 mg，赤蘚紅22.90 mg，亮藍(lán)24.00 mg，靛藍(lán)22.80 mg，置20 m L容量瓶中，加pH值為 6的水到刻度，配成標(biāo)準(zhǔn)儲備液備用。

2.3 供試品溶液的制備

取維生素包衣片適量，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，放入 100 m L小燒杯中，用水反復(fù)洗滌色素，到試樣無色素為止，合并色素漂洗液為試樣溶液。試樣溶液加檸檬酸溶液調(diào)pH值到6，加熱至60℃，將1 g聚酰胺粉加少許水調(diào)成粥狀，倒入試液溶液中，攪拌片刻，以 G3垂熔漏斗抽濾，用60℃pH值為4的水洗滌3～ 5次，后用甲醇-甲酸混合溶液洗滌3～ 5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5m L，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，轉(zhuǎn)移至5 m L容量瓶中，定容至刻度，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)圖譜的制備

精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液5 m L于100 m L量瓶中，加水定容至刻度，精密吸取10μL進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測定，得到色譜圖1。

圖1 8種合成著色劑的標(biāo)準(zhǔn)品RP-HPLC圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液 2 m L于100 m L量瓶中，加水稀釋定容至刻度，分別精密吸取 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0 m L于 100 m L量瓶中，用水定容至刻度，分別吸取 10μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，擬合回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，8種著色劑在0.050～ 1.037μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液 10μL進(jìn)入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測定5次，分別以檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)面積計(jì)算RSD分別為0.96%，0.45%，0.40%，0.37%，0.59%，2.48%，1.20%，0.42%。結(jié)果表明精密度良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別在0，2，4，12，24，48，72 h精密吸取“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，分別以檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)面積計(jì)算RSD分別為1.03%，0.75%，0.64%，0.71%，0.78%，2.78%，1.56%，0.72%。結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。

2.8 檢出限試驗(yàn)

精密吸取“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.05μL于100 m L量瓶內(nèi)，加水定容至刻度，搖勻，精密吸取10μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算當(dāng)信噪比為3時(shí)，檢出濃度為檢出限。檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)的檢出限分別為 0.12，0.12，0.21，0.06，0.15，0.85，0.94，0.14 ng，本方法的最低檢出濃度分別為0.012，0.024，0.042，0.012，0.030，0.085，0.094，0.014 mg/kg。

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密吸取“2.4”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 60μL加入到陰性樣品漂洗液中，按供試品溶液制備方法，平行制備3份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加標(biāo)回收率，見表1。結(jié)果表明，本方法回收率在94.09% ～ 100.34%之間，能滿足分析要求的準(zhǔn)確性。

2.10 樣品測定

分別取5種保健食品維生素片，按“2.4”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算樣品中8種合成著色劑的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

通過二極管陣列檢測器全波長掃描，8種合成著色劑在不同的波長下,吸收強(qiáng)度大小不同，綜合各種波長下相應(yīng)結(jié)果，在254 nm波長處8種合成著色劑均有較好的響應(yīng)值，故選擇254 nm作為檢測波長。由文獻(xiàn)[1-6]可知甲醇-乙酸銨為測定合成著色劑常用流動相，通過改變甲醇-乙酸銨的比例來實(shí)現(xiàn)8種合成著色劑的分離度符合要求，最后選擇甲醇-0.02mol/L乙酸銨梯度洗脫，新紅保留時(shí)間為10.185m in，檸檬黃保留時(shí)間為11.352 min，莧菜紅保留時(shí)間為12.388 m in，靛藍(lán)保留時(shí)間為14.035 m in，胭脂紅保留時(shí)間為19.767 m in，日落黃保留時(shí)間為24.442m in，亮藍(lán)保留時(shí)間為27.015min，赤蘚紅保留時(shí)間為29.758 m in。各成分的分離度均大于1.5，符合分析要求。

3.2 提取方法的選擇

通過比較直接用水浸泡和粉碎后用水洗滌，發(fā)現(xiàn)粉碎后用水洗滌提取比較完全，因此選擇將維生素片粉碎后直接用水洗滌。為減少雜質(zhì)對目標(biāo)成分的干擾，參考有關(guān)文獻(xiàn)，選擇用聚酰胺吸附色素，用甲醇-甲酸混合溶液除去天然色素干擾，再用乙醇-氨水-水混合溶液解吸目標(biāo)成分。

3.3 合成著色劑對人體的危害

合成著色劑采用人工化學(xué)合成的方法，主要通過從煤焦油中分離得到的苯胺燃料等作為原料，通過一系列化學(xué)反應(yīng)生成具有各種顏色的化學(xué)物質(zhì)，其中大多是偶氮類型化合物，多數(shù)偶氮類化合物可以在人體內(nèi)代謝生成具有毒副作用的物質(zhì)，過量食用將對人體健康造成一定危害。因此國家對合成著色劑的添加和食用制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，從安全角度來說，只要在國家標(biāo)準(zhǔn)許可范圍內(nèi)，就不會對健康造成危害，然而經(jīng)常食用添加著色劑的保健食品維生素片也會造成合成著色劑攝入過量。因此，廣大消費(fèi)者在購買和使用保健食品維生素片時(shí)一定要注意其中是否添加合成著色劑，盡量選擇沒有添加合成著色劑的產(chǎn)品，從而減少合成著色劑的攝入。

3.4 結(jié)論

本文建立了RP-HPLC同時(shí)測定保健食品維生素片中8種合成著色劑的含量，該方法精密度、穩(wěn)定性良好，檢出限低，重現(xiàn)性好，能夠較好地應(yīng)用于維生素片中合成著色劑的測定，為維生素片的市場監(jiān)管和質(zhì)量控制提供了一定的技術(shù)支持，同時(shí)提醒消費(fèi)者對合成著色劑的關(guān)注。

[1] 咸瑞卿，王小兵，李啟艷，等.固相萃取-高效液相色譜-二極管陣列檢測法同時(shí)測定飲料中10種合成著色劑[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（6）：1413-1416.

[2] 李湘平，莫金娜，李汶，等.14批抗生素膠囊劑囊殼中人工合成色素的檢測結(jié)果分析[J].中國藥事，2012，26（8）：884-887.

[3] 程春梅，彭進(jìn)，董劉敏.高效液相色譜法同時(shí)檢測果汁飲料中的六種合成著色劑[J].食品科技，2011，36（10）：301-304.

[4] 肖海龍，屠海云，王紅青，等.反相高效液相色譜法快速測定食品中18種水溶性合成著色劑[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜質(zhì)，2011，21（2）：264-266.

[5] 李家珂.蜜餞類食品中人工合成著色劑含量測定及分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2009，16（7）：128-129.

[6] 劉海山，錢曉燕，呂春華，等.高效液相色譜法同時(shí)測定化妝品中的10種合成著色劑[J].色譜，2013，31（11）：1106-1111.

Simultaneous Determ ination of 8 Edible Synthetic Colorants in Vitam in Tablets by RP-HPLC

Wang M ingzhi，Wang Yingyu，Chen Rong，Zhang Chao，Zhang Huafeng，Gu Bingren（Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China）

Objective:To establish a method for simultaneous determ ination of 8 synthetic colorants in vitam in tablets by RP-HPLC.Methods:Chromatographic column C18（250 mm ×4.6 mm，7μm）was used and the mobile phase wasmethanol-0.02 mol/L ammonium acetate with gradient elution.The detection wavelength was at 254 nm.Results:There was a good linearity between the peak area and concentrations of 8 synthetic colorants w ithin the range of 0.050～1.037μg/m L（r＞ 0.999）,and the average recoveries were 94.09%～100.34%.Conclusion:The method is stable,sensitive,convenient and fast,and can be used as a method for the determ ination of synthetic colorants in vitam in tablets.

RP-HPLC；Edible Synthetic Colorant；Vitam in Tablet；Content

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.07.003

2015-03-10）

汪明志，男，中藥師。研究方向：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：2279792632@qq.com