張文博，吳 闖

（遼寧石油化工大學 化學化工與環(huán)境學部，遼寧 撫順 113001）

甲醛對鹵蟲的急性毒性研究

張文博，吳 闖

（遼寧石油化工大學 化學化工與環(huán)境學部，遼寧 撫順 113001）

為評估甲醛對水環(huán)境的毒性影響，以美國大鹽湖鹵蟲為受試生物，采用概率單位法研究了甲醛對鹵蟲的急性毒性效應。結果表明：在25 ℃條件下，甲醛對鹵蟲的24 h LC50為16.765 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.277 mg·L-1；48 h LC50為4.783 mg·L-1，95%置信限度：4.450～5.105 mg·L-1。培養(yǎng)48 h甲醛對鹵蟲的致死作用比24 h顯著增加，且48 h濃度響應范圍也小于24 h響應范圍。同時發(fā)現(xiàn)鹵蟲中毒后癥狀與已報道的其他物質(zhì)中毒癥狀有所不同。

甲醛；鹵蟲；急性毒性；概率單位法

甲醛常溫下是一種無色、有強烈刺激性氣味的氣體，易溶于水及醇、醚等多種有機溶劑。近年來，由于生活水平的提高，由室內(nèi)裝修和各種消費品使用造成的室內(nèi)甲醛污染已經(jīng)引起人們的高度重視，其對人體及小鼠等生物的毒性危害及中毒機制已經(jīng)進行了大量研究[1,2]。同時，甲醛作為一種重要的有機原料在工業(yè)上的廣泛應用，產(chǎn)生了大量含甲醛廢水，對環(huán)境的危害同樣巨大，因此甲醛對水體的污染及其對水生生物毒性也在日益引起關注[3]。目前對于水生生物的毒性研究多見于水產(chǎn)養(yǎng)殖品種及個別模式生物[4-6]。鹵蟲作為一種環(huán)境監(jiān)測生物，其急性毒性試驗已經(jīng)被國際會議確定并標準化[7]。其具有生活周期短、對毒物敏感、易于保存和培養(yǎng)等優(yōu)點，已被廣泛用于水生生物毒理學研究中。本文以大鹽湖鹵蟲卵為對象，進行甲醛對鹵蟲急性毒性的研究，為水體環(huán)境監(jiān)測及甲醛廢水處理提供實驗依據(jù)及生物學參考。

1 實驗部分

1.1 受試生物

以美國大鹽湖鹵蟲（Artemia.francisana）作為受試生物，購自天津中鹽制鹽工程技術研究院。與國產(chǎn)鹵蟲卵相比，大鹽湖鹵蟲卵質(zhì)量更高，孵化率和成活率都較高，且更易培養(yǎng)。鹵蟲卵在光照培養(yǎng)箱中孵化，孵化條件為(25±1)℃，2 000 lux光照，光照時間比為12:12（光照，黑暗），小型氣泵充氣攪拌。選取24 h內(nèi)孵出的鹵蟲，轉移至另外容器在相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，得到Ⅱ～Ⅲ齡的鹵蟲無節(jié)幼體。

1.2 試劑

甲醛分別采用37%水溶液（福爾馬林）和甲醛溶液標準物質(zhì)（100μg/mL，100 mL）購于北京盈澤納新化工技術研究院。

1.3 實驗用水

實驗用水采用人工海水，pH= 8.0±0.5，鹽度（35 ±1）‰，其組成為： 23.70 g·L-1NaCl、0.54 g·L-1KCl、6.29 g·L-1MgSO4·7H2O、4.5 g·L-1MgCl2·6H2O、0.15 g·L-1CaCl2、0.04 g·L-1NaHCO3和蒸餾水[8]。

1.4 預試驗

用人工海水將福爾馬林稀釋成不同濃度，稀釋前提高人工海水鹽度，使稀釋后鹽度為（35±1）‰。于50 mL小燒杯中加入25 mL甲醛溶液，投入10只鹵蟲幼體，分別在24 h和48 h觀察死亡情況，找出48 h使全部鹵蟲未發(fā)生死亡的最高濃度和24 h全部死亡的最低濃度，以確定試驗所需濃度范圍。

1.5 急性毒性試驗

在300 mL燒杯中加入150 mL實驗用甲醛人工海水溶液，該溶液由甲醛標準物質(zhì)配制至相應濃度。每只燒杯投入30只Ⅱ～Ⅲ齡的鹵蟲無節(jié)幼體。每個水平設置2個平行組，取平均值作為結果，同時設空白對照。在光照培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，(25±1)℃，2 000 lux光照，光照時間比為12:12（光照，黑暗）。實驗過程中不投餌不充氣。分別于培養(yǎng)24 h和48 h記錄各組鹵蟲死亡數(shù)量，在解剖鏡下觀察，以10 s內(nèi)鹵蟲幼體無明顯運動作為死亡判斷標準。用SPASS19.0進行數(shù)據(jù)分析，用概率單位法求出24 h LC50和48 h LC50。

2 結果與分析

2.1 預試驗確定甲醛濃度范圍

經(jīng)過預試驗，確定培養(yǎng)24 h和48 h甲醛濃度范圍分別如表1所示。在此范圍，死亡率隨濃度增加有明顯變化。

2.2 鹵蟲的中毒癥狀觀察

試驗中發(fā)現(xiàn)，鹵蟲中毒后有一段平穩(wěn)期，泳動情況與對照組相比無異常，濃度越高這段平穩(wěn)期越短。平穩(wěn)期過后，泳動速度明顯加快，最后短時間內(nèi)減慢至失去運動能力，沉入水底。對于甲醛中毒，鹵蟲失去運動能力和死亡之間幾乎無過渡。

表1 試驗用甲醛濃度Table 1 Concentration of formaldehyde in test mg·L-1

鹵蟲對甲醛的中毒癥狀與其他物質(zhì)的中毒癥狀有所不同，如柴油使鹵蟲活動能力下降，運動遲緩直至沉在水底不停顫動[9]；恩諾沙星也可以使鹵蟲出現(xiàn)運動遲緩，肢角擺動頻率下降，趨光性變?nèi)醯默F(xiàn)象[10]；而甲醛使鹵蟲運動更加活躍，并且極大縮短了從活動減慢到死亡的時間，一旦沉入水底基本已經(jīng)死亡。這種差異顯示甲醛中毒和其他物質(zhì)中毒機理的不同，但具體機理如何，尚未見明確報道。本試驗采取的死亡判定方法為觀察鹵蟲10 s內(nèi)不動即為死亡，正是以鹵蟲上述中毒特點為依據(jù)，使得試驗更加簡單易行。這一點與有些報道所采用的針刺的方法有所不同[9]。

2.3 急性毒性試驗結果

將試驗結果用SPSS19.0軟件分析，表2為采用概率單位法計算24 h和48 h每組試驗數(shù)據(jù)殘差及相應的致死概率。其中濃度為取對數(shù)后的結果。

表2 單元計數(shù)和殘差Table 2 Cell count and residual

表3為經(jīng)過回歸計算后24 h和48 h各濃度預測值對應的死亡概率及其95%置信限度，為節(jié)省篇幅未全部列出。由表中可以看出，兩個時間組的死亡率均隨濃度增加而上升，但在24 h組中，發(fā)生死亡的濃度范圍較大，即隨濃度的增加死亡率上升較慢；在48 h組中，發(fā)生死亡的濃度范圍比較集中，即在該濃度范圍內(nèi)，死亡率隨濃度增加迅速上升。

表 4為軟件最后給出的回歸模型，Pearson 擬合度檢驗結果表明概率單位與濃度對數(shù)曲線相關性顯著，所以回歸模型完全符合要求。24 h LC50為16.765 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1；48 h LC50為 4.783 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1。

表3 置信限度Table 3 Confidence limits

甲醛毒性的研究較多見于哺乳動物如小鼠和人等，對水生生物的毒性研究相對較少。鹵蟲作為受試生物已經(jīng)被廣泛的應用于水環(huán)境污染物的毒性評價和生態(tài)毒理學的研究[11]。它具有個體小、對環(huán)境變化反應靈敏、易于長期保存和實驗操作，并且可在實驗室內(nèi)大量培養(yǎng)等特點，因而比其他水生受試生物如大型水蚤、貝類、斑馬魚等更具優(yōu)勢[12]，已被用來評估鉆井液[13]、重金屬離子[14]、農(nóng)藥[8]等有毒物質(zhì)及某些藻類[15]的生物毒性。有研究表明，甲醛對水蚯蚓的24 h LC50為24.28 mg·L-1，48 h LC50為20 mg·L-1[4]；對泥鰍的24 h LC50為461.23 mg·L-1，48 h LC50為425.32 mg·L-1[5]溞；對中華虎頭蟹Ⅱ期 狀幼體24 h LC50為 131.036 μL·L-1，48 h LC50為 110.296 μL·L-1[6]。相比之下，鹵蟲對甲醛更加敏感，更適于對水中甲醛進行生物監(jiān)測。

表4 甲醛對鹵蟲幼體急性毒性效應Table 4 The acute toxicity of formaldehyde on Artemia.francisana

市售甲醛試劑一般為37%～40%的甲醛溶液，其中為防止甲醛聚合有些產(chǎn)品中加入15%左右的甲醇作為阻聚劑。為保證試驗結果的準確，本試驗中在預試驗階段采用的市售甲醛試劑初步確定死亡濃度范圍，在正式試驗中采用甲醛溶液標準物質(zhì)，其中甲醛含量較低抑制了聚合現(xiàn)象，并且濃度精確不含阻聚劑，可直接用于試驗而無需再次標定。目前一些文獻中的甲醛濃度實際是甲醛溶液濃度，對其毒性的評價與純甲醛相比是有區(qū)別的。

本試驗的數(shù)據(jù)處理采用 SPSS19.0軟件，它和SAS、BMDP并稱為國際上最有影響的三大統(tǒng)計軟件。在國際學術交流中，凡是用 SPSS軟件完成的計算和統(tǒng)計分析，可以不必說明算法，其統(tǒng)計結果被國際同行廣泛認可。該軟件能根據(jù)回歸模型，計算出各濃度對應的概率，并給出95%置信限度，在進行半致死濃度研究中非常方便。

3 結 論

甲醛對鹵蟲的24 h LC50為16.765 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1；48 h LC50為4.783 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1。鹵蟲對甲醛敏感，適于用來對其進行生物監(jiān)測。中毒48h對應的死亡濃度范圍明顯小于中毒24 h，且甲醛中毒癥狀與其他物質(zhì)中毒癥狀不同，具體機理有待進一步研究。

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Study on Acute Toxicity of Formaldehyde on Artemia.francisana

ZHANG Wen-bo，WU Chuang
（College of Chemistry, Chemical Engineering and Environmental Engineering, Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001，China）

For evaluating the toxicity of formaldehyde in aquatic environment, Artemia.francisana was used as test organism to study the acute toxicity of formaldehyde by probit method. The results show that, at 25 ℃ the 24 h LC50is 16.765 mg·L-1, and its 95% confidence limit is 15.105～18.277 mg·L-1; the 48 h LC50is 4.783 mg·L-1, and its 95% confidence limit is 4.450～5.105 mg·L-1. The lethal effect of formaldehyde after 48 h culture is more significant than that of 24 h, and the concentration response range is also the same. The behavior response of Artemia.francisana to formaldehyde is different from other reagents reported.

Formaldehyde; Artemia.francisana; Acute toxicity; Probit

X 835

A

1671-0460（2015）08-1788-03

2015-07-13

張文博（1994-），男，遼寧沈陽人，研究方向：生物化工。E-mail：zhangwbbio@sina.com。

吳闖（1973-），男，碩士，研究方向：生物工程。E-mail：wuchuang2000@sina.com。