王文文,許明君,俞冰博,張 博,洪 娟,傅 力,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052；2.韓山師范學(xué)院生物系,廣東潮州 521041)

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響應(yīng)面法優(yōu)化杏皮渣汁酒精連續(xù)發(fā)酵工藝

王文文1,許明君1,俞冰博1,張 博1,洪 娟2,傅 力2,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052；2.韓山師范學(xué)院生物系,廣東潮州 521041)

采用固定化果酒酵母,產(chǎn)酯酵母和腸膜明串珠菌的混合菌細胞進行酒精連續(xù)發(fā)酵杏皮渣汁工藝的研究。以酒精度為指標,采用響應(yīng)面實驗設(shè)計法優(yōu)化接種量、稀釋率和可溶性固形物對酒精度的影響,同時建立數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明:酒精連續(xù)發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)是:在稀釋率0.02h-1,接種量16g/100mL,可溶性固形物17%,溫度30℃,pH3.8的條件下,雙級連續(xù)酒精發(fā)酵所得酒精度最高,模型預(yù)測值為6.3%(v/v),與驗證實驗得到的酒精度6.18%(v/v),僅相差0.12%(v/v),從而證明了模型的可靠性。

酒精發(fā)酵,連續(xù)發(fā)酵,響應(yīng)面法,固定化細胞

杏皮渣是杏濃縮漿加工過程中的副產(chǎn)物,研究表明杏皮渣中含有大量的多糖、粗脂肪、果膠、蛋白質(zhì)、粗纖維、氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素,其營養(yǎng)成分接近杏果實,加工產(chǎn)品仍能保持其特有的風味[1]。新疆杏皮渣產(chǎn)量大,一般作為飼料或肥料被利用,利用率低,產(chǎn)品附加值小[2]。將杏皮渣用于釀酒、制醋,能有效解決杏皮渣的利用問題。

目前關(guān)于采用固定化微生物細胞酒精連續(xù)發(fā)酵杏皮渣汁的研究尚鮮有報道。連續(xù)發(fā)酵排除了微生物的遲滯期和產(chǎn)物的抑制效應(yīng),具有產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,生產(chǎn)效率高,容易控制等優(yōu)點[3-4]。固定化細胞能持續(xù)增殖、細胞密度大、發(fā)酵周期短,與連續(xù)發(fā)酵結(jié)合能有效解決游離細胞連續(xù)發(fā)酵菌體濃度低、發(fā)酵時間長等缺點[5-6]。

申渝[7]等采用攪拌式罐串聯(lián)多級填料管進行高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵,研究表明增加連續(xù)發(fā)酵反應(yīng)器的級數(shù)對提高乙醇濃度的效果要優(yōu)于降低進料速度。季更生[8]等采用樹干畢赤酵母對15g/L木糖和30g/L葡萄糖混合發(fā)酵底物進行二級串聯(lián)酒精連續(xù)發(fā)酵,結(jié)果表明在發(fā)酵溫度35℃,底物流加速度30mL/h的條件下,平均發(fā)酵酒精度達15.22g/L。賈東晨[9]等利用管式反應(yīng)器模擬連續(xù)發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)乙醇的工藝,結(jié)果表明,提高原料的稀釋率,乙醇的產(chǎn)率與稀釋率成正比。 郭學(xué)武[10]等利用混合固定化克魯維酵母和固定化釀酒酵母對乳清粉進行了單級和雙級串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵,研究發(fā)現(xiàn)增加單級連續(xù)發(fā)酵中發(fā)酵液的循環(huán)流動對提高發(fā)酵速度和酒精度有幫助。Smogrovicova D[11]等研究了連續(xù)氣升式反應(yīng)器和固定化酵母對啤酒發(fā)酵參數(shù)和質(zhì)量的影響,研究發(fā)現(xiàn)固定化生物量越大,發(fā)酵時間越短,當固定化生物量和麥芽汁體積比為0.27∶1(v/v)時,啤酒的生產(chǎn)率和質(zhì)量最高。本研究應(yīng)用固定化微生物細胞連續(xù)發(fā)酵技術(shù)研究杏皮渣汁酒精發(fā)酵工藝,以期為杏皮渣的開發(fā)利用和固定化酵母酒精連續(xù)發(fā)酵提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

果酒酵母和產(chǎn)酯酵母 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供；腸膜明串珠菌(菌株編號22731) 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；杏皮渣 杏皮渣由新疆輪臺縣華隆農(nóng)林開發(fā)有限公司提供；孟加拉紅 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；MRS固體培養(yǎng)基 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；海藻酸鈉 化學(xué)純;聚乙烯醇 分析純；二氧化硅、碳酸鈣 均為分析純；果膠酶 酶活力為1.8萬U/mg,江蘇銳陽生物科技有限公司；纖維素酶 酶活力為1萬U/g,江蘇銳陽生物科技有限公司。

蠕動泵 BT00-100M,常州科健蠕動泵廠；恒溫水浴鍋 HWS26,上海一恒科技有限公司；型手持糖度儀 WYT,成都光學(xué)廠；全玻璃雙層發(fā)酵罐(定制) 臺州市椒江玻璃儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏皮渣汁的制備 杏皮渣和水以1∶5(g/mL)的比例浸泡,添加果膠酶0.5%(g/100mL),纖維素酶2%(g/100mL),49℃,酶解時間4h,過濾后調(diào)整糖度17%,121℃滅菌20min備用。

1.2.2 固定化酵母的制備工藝

1.2.2.1 果酒酵母及產(chǎn)酯酵母菌菌懸液的制備 在2瓶200mL杏皮渣汁中分別接入2環(huán)果酒酵母及2環(huán)產(chǎn)酯酵母,28℃,110r/min搖床培養(yǎng)24h；取培養(yǎng)液10mL,5000r/min離心15min,倒去上清液,并用無菌蒸餾水將菌體洗滌3次后,稱取濕菌體2.0g,用無菌生理鹽水配制成含酵母菌2.0g/100mL的菌懸液。

1.2.2.2 腸膜明串珠菌菌懸液的制備 在200mL乳酸菌液體培養(yǎng)基中接入2環(huán)活化后的腸膜明串珠菌,30℃,110r/min搖床培養(yǎng)36h；取培養(yǎng)液10mL,5000r/min離心15min,倒去上清液,并用無菌蒸餾水將菌體經(jīng)3 次洗滌后,稱取濕菌體2.0g,用無菌生理鹽水配制成含乳酸菌2.0g/100mL的菌懸液。

1.2.2.3 混合菌種菌懸液的制備 按果酒酵母菌懸液∶產(chǎn)酯酵母菌懸液∶腸膜明串珠菌菌懸液為2∶2∶1(v/v)的比例進行混合得到混合菌種的菌懸液。

1.2.2.4 固定化細胞的制備 稱取海藻酸鈉4g、聚乙烯醇3.2g、二氧化硅1.6g、碳酸鈣為0.6g,溶于100mL水中,混合均勻,121℃滅菌20min,冷卻至室溫后,加入8%(v/v)混合菌種的菌懸液,攪拌均勻,用5mL注射器滴入濃度為2.0%∶3.5%(g/100mL)的氯化鈣-硼酸固化劑中,保鮮膜封口,4℃固化24h。

1.2.3 雙級連續(xù)發(fā)酵流程 如圖1所示,發(fā)酵裝置為雙層全玻璃發(fā)酵罐,發(fā)酵罐體積為1120cm3,有效容積為840cm3。采用循環(huán)水進行溫度控制,蠕動泵進行流量控制。裝置連接完成后,將固定化酵母放于發(fā)酵罐下部的多孔隔板上,杏皮渣汁填充至發(fā)酵液出口位置。連續(xù)發(fā)酵開始前先進行48h的分批發(fā)酵,之后啟動泵,杏皮渣汁以恒定的流量從進料口流入,同時收集出料口的發(fā)酵液,每隔12h測定一次酒精度,連續(xù)2次酒精度一致,視為發(fā)酵進入穩(wěn)態(tài)。

圖1 雙級串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵示意圖Fig.1 The schematic diagram of a two-stage continuous fermentation system注：1.儲料瓶,2.濾膜,3.恒溫水浴鍋,4.蠕動泵,5.全玻璃發(fā)酵裝置,6.多孔隔板,7.進料口,8.出料口。

1.2.4 酒精連續(xù)發(fā)酵單因素實驗設(shè)計

1.2.4.1 單級連續(xù)酒精發(fā)酵可行性的探索 分別設(shè)定稀釋率為0.01、0.02、0.03、0.04h-1,發(fā)酵溫度為30℃,接種量為16g/100mL,可溶性固形物為17%,pH自然,發(fā)酵進入穩(wěn)態(tài)時測定其酒精度,以酒精度為衡量指標,探索單級連續(xù)發(fā)酵的可能性。

1.2.4.2 不同稀釋率對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 分別設(shè)定稀釋率為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05h-1,發(fā)酵溫度為30℃,接種量為16g/100mL,可溶性固形物為17%,pH自然,發(fā)酵進入穩(wěn)態(tài)時測定其酒精度,以酒精度為衡量指標,確定稀釋率大小。

1.2.4.3 不同濃度可溶性固形物對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 分別設(shè)定可溶性固形物為13%、14%、15%、16%、17%,發(fā)酵溫度為30℃,接種量為16g/100mL,pH自然,發(fā)酵進入穩(wěn)態(tài)時測定其酒精度,以酒精度為衡量指標,確定可溶性固形物的含量。

1.2.4.4 不同pH對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 分別設(shè)定pH為3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2,發(fā)酵溫度為30℃,接種量為16g/100mL,發(fā)酵進入穩(wěn)態(tài)時測定其酒精度,以酒精度為衡量指標,確定最佳pH。

1.2.4.5 不同接種量對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 分別設(shè)定接種量為10、12、14、16、18、20g/100mL,發(fā)酵溫度為30℃,發(fā)酵進入穩(wěn)態(tài)時測定其酒精度以酒精度為衡量指標,確定接種量大小。

1.2.4.6 不同溫度對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 分別設(shè)定發(fā)酵溫度為28、30、32、34、36℃,發(fā)酵進入穩(wěn)態(tài)時測定其酒精度,以酒精度為衡量指標,確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.5 雙級連續(xù)酒精發(fā)酵條件優(yōu)化 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇稀釋率、可溶性固形物、接種量進行3因素3水平響應(yīng)面實驗設(shè)計(如表1),并通過Design-Expert8.0進行數(shù)據(jù)處理,得到雙級連續(xù)酒精發(fā)酵階段的最佳工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平表Table1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 分析方法 酒精度測定:采用GB/T 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法?？扇苄怨绦挝餃y定:手持糖度儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單級連續(xù)酒精發(fā)酵可行性探索

由圖2可知,單級連續(xù)發(fā)酵的酒精度隨著稀釋率的提高逐漸降低,當稀釋率為0.01h-1時,酒精度最大為4.5%(v/v),當稀釋率為0.03h-1時,酒精度急劇下降為2.4%(v/v),當稀釋率為0.04h-1時,酒精度最小為1.9%(v/v)。按產(chǎn)品要求,初始酒精度一般為5%～6%(v/v)左右,而根據(jù)國標GB18187-2000釀造食醋的規(guī)定,釀造食醋總酸必須達到3.5g/100mL。理論上100g酒精只能生成100g醋酸,單級連續(xù)發(fā)酵要想滿足實際生產(chǎn)的需要必須在極低的稀釋率條件下,才能勉強達到[12]。因此,單級連續(xù)酒精發(fā)酵不適合應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

圖2 不同稀釋率對單級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of dilution rates on single-stage continuous alcohol fermentation

2.2 雙級連續(xù)酒精發(fā)酵單因素實驗

2.2.1 不同稀釋率對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 由圖3可知,相較于單級發(fā)酵,雙級發(fā)酵的發(fā)酵酒精度有明顯的提高。隨著稀釋率的提高,酒精度逐漸降低,當稀釋率為0.01h-1時,酒精度最高為6.6%(v/v),當稀釋率為0.03h-1時,酒精度下降至6.0%(v/v),當稀釋率為0.05h-1時,酒精度最低4.8%(v/v)。稀釋率的高低應(yīng)該控制在一定范圍內(nèi),過低的稀釋率會造成菌體生長過濃,發(fā)酵罐中殘?zhí)?、酒度和菌體生物量的濃度呈現(xiàn)大幅度的周期性波動,過高的稀釋率又會造成菌體被洗出,產(chǎn)物得不到積累[13]。因此,綜合考慮,選擇雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的稀釋率為0.03h-1。

圖3 不同稀釋率對雙極連續(xù)酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of dilution rates on two-stage continuous alcohol fermentation

2.2.2 不同濃度可溶性固形物對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 由圖4可知,隨著可溶性固形物濃度的增加,發(fā)酵酒精度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當可溶性固形物濃度為13%時,酒精度最低為4.0%(v/v),當可溶性固定物濃度增加至16%時,酒精度最高為6.1%(v/v),當可溶性固形物濃度高于16%時,發(fā)酵酒精度開始下降,可能是由于可溶性固形物濃度太高,影響了酵母菌的繁殖和代謝?？扇苄怨绦挝餄舛冗^低會抑制酵母菌的生長,影響次級代謝產(chǎn)物的積累,而濃度太高,又會導(dǎo)致高級醇、琥珀酸等副產(chǎn)物生成量增加,造成口感苦澀刺喉[14]。因此選擇可溶性固形物濃度為16%。

圖4 不同濃度可溶性固形物對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of soluble solids concentration on two-stage continuous alcohol fermentation

2.2.3 不同pH對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 由圖5可知,隨著pH的不斷升高,酒精度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,當pH為3.8時,酒精度達到最大為5.8%(v/v),當pH大于3.8時,隨著pH的增長,酒精度開始下降,可能是由于pH過高,影響了酵母菌的生長代謝導(dǎo)致了酒精度的下降。選擇pH為3.8。

圖5 不同pH對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of pH on two-stage continuous alcohol fermentation

2.2.4 不同接種量對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 由圖6可知,隨著接種量的提高,酒精度急劇升高,當接種量達到16g/100mL時,酒精度最高為6.0%(v/v),當接種量大于16g/100mL以后,酒精度又開始急速減小。接種量過小,酵母數(shù)量不足,酒精產(chǎn)量較少,發(fā)酵不徹底,殘?zhí)歉?酵母易老化。接種量過大,大量的糖被酵母生長所代謝,產(chǎn)酸更多的代謝廢物,不利于發(fā)酵[15]。選擇接種量為16g/100mL。

圖6 不同接種量對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of inoculums on two-stage continuous alcohol fermentation

2.2.5 不同溫度對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響 由圖7可知,隨著溫度的不斷提高,酒精度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,當發(fā)酵溫度為30℃時,酒精度達到最大為5.8%(v/v),之后隨著發(fā)酵溫度的不斷升高,酒精度下降顯著。發(fā)酵過程中菌體最大的生物活性一般只能維持在很小的溫度范圍內(nèi),發(fā)酵溫度過高會造成菌體的老化,發(fā)酵溫度過低會抑制菌體的生長。因此選擇發(fā)酵溫度為30℃。

圖7 不同溫度對雙級連續(xù)酒精發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on two-stage continuous alcohol fermentation

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化酒精連續(xù)發(fā)酵工藝

2.3.1 酒精連續(xù)發(fā)酵模型建立 根據(jù)單因素實驗結(jié)果和前人實驗的結(jié)果[1]得出,杏皮渣汁酒精發(fā)酵在自然pH時(即不用調(diào)節(jié)pH,大約為4),溫度在30℃時,就足以滿足發(fā)酵的需要,因而選取發(fā)酵溫度30℃,pH 3.8,以接種量、稀釋率、可溶性固形物為因素,采用Box-Behnken實驗設(shè)計,實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

根據(jù)實驗結(jié)果建立酒精度(Y)與發(fā)酵工藝參數(shù)的數(shù)學(xué)模型為:

Y=-89.1375+4.63125X1+361.25X2+6.275X3-10X1X2+0.0875X1X3-7.5X2X3-0.175X12-2000X22-0.225X32

通過對上述回歸方程進行方差分析,得到各參數(shù)的顯著度,結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計表及結(jié)果Table2 The design matrix and results of Box-Behnken experiments

表3 實驗結(jié)果方差分析表Table3 Variance analysis of Result experiments

注:極顯著p<0.01,顯著p<0.05。

由表3可知,二次回歸方程整體模型顯著,失擬項不顯著,模型選擇合適,由軟件分析得到模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.9853,調(diào)整后R2為0.9663,說明模型擬合度好,響應(yīng)值96.63%是由所選變量引起的,可以利用該方程確定最佳的發(fā)酵工藝。

對模型中的回歸性系數(shù)進行顯著性檢驗可以看出(表3),該二次回歸方程的一次項、二次項以及交互項X1X2、X1X3對發(fā)酵酒精度有極顯著的影響(p<0.01)。根據(jù)二次回歸方程各個值的絕對值大小可以得到三個因素對發(fā)酵酒精度的影響順序為稀釋率>接種量>可溶性固形物。酒精連續(xù)發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為稀釋率為0.02h-1,接種量為16g/100mL,可溶性固形物為17%時,預(yù)計酒精度為6.3%(v/v)。采用最佳工藝參數(shù)對杏皮渣汁進行酒精連續(xù)發(fā)酵后,取5d發(fā)酵酒精度的平均值,得到實際酒精度為6.18%(v/v),同預(yù)測值接近,說明模型切實可行。

2.3.2 交互作用分析 由圖8可知,響應(yīng)曲面較為陡峭,等值線圖呈橢圓狀,說明因素接種量和因素稀釋率之間交互作用顯著。在接種量一定時,酒精度隨著稀釋率的提高而降低,在0.02h-1附近達到最大值；在稀釋率一定時,酒精度隨著接種量的升高,曲面先升高后降低,在16%～17%范圍內(nèi)酒精度達到最大。

圖8 接種量(X1)和稀釋率(X2)相互作用響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot for interaction of inoculums(X1)and dilution rate(X2)

由圖9可知,X1X3的交互作用顯著,在接種量一定時,酒精度隨著可溶性的提高先增大后減小,在16%～17%范圍內(nèi)時達到最大值,在可溶性固形物一定時,酒精度隨著接種量的提高先增大后減小,在16%～17%的范圍內(nèi)達到最大。

圖9 接種量(X1)和可溶性固形物(X3)相互作用響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot for interaction of inoculums(X1)and soluble solids(X2)

3 結(jié)論

采用雙級連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)對杏皮渣汁進行酒精發(fā)酵,通過響應(yīng)面法對接種量、稀釋率、可溶性固形物進行優(yōu)化,結(jié)果顯示3個因素對酒精度的影響是顯著的,影響的主次順序是稀釋率>接種量>可溶性固形物。利用統(tǒng)計學(xué)建立的二次多項式模型,確定了杏皮渣醋酒精連續(xù)發(fā)酵階段的最佳工藝參數(shù)是:稀釋率為0.02h-1,接種量為16g/100mL,可溶性固形物為17%,發(fā)酵溫度30℃,pH3.8,預(yù)計酒精度為6.3%(v/v)。驗證實驗得到的發(fā)酵酒精度為6.18%(v/v),與模型非常接近,從而驗證了模型的可靠性。

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Conditions optimization of continuous fermentation of apricot dreg juice by response surface methodology

WANG Wen-wen1,XU Ming-jun1,YU Bing-bo1,ZHANG Bo1,HONG Juan2,FU Li2,*

(1.College of Food Science and Pharmaceutical Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.Department of Biology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China)

The conditions optimization of continuous fermentation with co-immobilization of wine yeast,ester-producing yeast and leuconostoc mesenteroides by apricot dreg juice were studied. Taking the alcohol content as measurement index,the fermentation conditions which included the inoculums,the dilution rate and soluble solids content were optimized by response surface methodology. The mathematical model of alcohol content with inoculums,dilution rate and soluble solids was established. The results were as follows:dilution rate 0.02h-1,inoculums 16g/100mL,soluble solids content 17%,fermentation temperature 30℃,pH3.8. In this conditions the predicted value of alcohol content was 6.3%(v/v),which was in consistent with the measured value 6.18%(v/v).

alcohol fermentation;continuous fermentation;response surface methodology;immobilized cells

2014-08-21

王文文(1987- )，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAD27B02-04-01)。

TS255.1

B

:1002-0306(2015)09-0234-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.042

*通訊作者:傅力(1964- )，女，碩士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)。