齊麗寧，張霞，徐淑穩(wěn)，李學(xué)慧，孟亞麗，鄭燕，代麗麗，張華林，張紅真

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年該病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。let-7i是一種重要的微小 RNA（miRNA），是let-7家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤組織或細(xì)胞中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等密切相關(guān)[2-3]，但其在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義尚不明確。本研究應(yīng)用多聚腺苷酸加尾實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)[poly（A）-RT-qPCR]技術(shù)對(duì)let-7i在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，初步探討let-7i在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為進(jìn)一步的研究提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011年4月—2014年12月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜癌患者40例，年齡37～72歲，平均（54.68±7.21）歲；子宮內(nèi)膜不典型增生患者20例，年齡36～73歲，平均（51.80±9.72）歲；子宮內(nèi)膜正常的患者 30例（包括異常子宮出血及子宮肌瘤患者），年齡30～70歲，平均（51.83±8.95）歲；3組間年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.283，P=0.282）。子宮內(nèi)膜癌患者手術(shù)前未進(jìn)行放療及藥物治療，征得患者及家屬同意，簽署知情同意書(shū)后取子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本迅速置于液氮中保存，所有標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)過(guò)病理證實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 應(yīng)用總RNA抽提試劑（Trizol，美國(guó)Invitrogen公司）分批對(duì)40例子宮內(nèi)膜癌、20例子宮內(nèi)膜不典型增生及30例正常子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行總RNA的提?。ň唧w方法參照說(shuō)明書(shū)）。用超微量分光光度計(jì)（ND-1000，美國(guó)NanoDrop公司）檢測(cè)總RNA濃度和純度，所有標(biāo)本總RNA吸光度的比值（A260/A280）均在1.8～2.1之間，表明RNA純度好。

1.2.2 互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）的合成 應(yīng)用poly（A）-RT-qPCR試劑盒（All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit，購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司），對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，配成25 μL反應(yīng)液：總RNA 1～5 μg（本實(shí)驗(yàn)選用1 μg）根據(jù)總RNA濃度計(jì)算出所需體積、2.5 U/μL 多聚 A 聚合酶 1 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶混合物 1 μL、5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL、無(wú)核酶雙蒸水補(bǔ)齊至總反應(yīng)液為25 μL。反應(yīng)條件：37℃ 60 min，85℃ 5 min。

1.2.3 let-7i的RT-qPCR Poly（A）-RT-qPCR試劑盒（同前），let-7i及內(nèi)參U6的引物均購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司，選用的儀器為7500型快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)配成20 μL反應(yīng)液：2×Allin-One qPCR 混合物 10 μL、All-in-OneTMmiRNA qPCR 引物（2 μmol/L）2 μL、通用 PCR 隨機(jī)引物（2 μmol/L）2 μL、單鏈cDNA（稀釋 5 倍）2 μL、50×ROX 參化染料 0.4 μL、雙蒸水 3.6 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min，然后95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)得到let-7i及U6在各標(biāo)本中的CT值，并按公式：△CT=CTlet-7i－CTU6，計(jì)算出△CT 值，let-7i在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生及正常子宮內(nèi)膜組織中的相對(duì)表達(dá)量用2-△CT法計(jì)算[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量資料符合正態(tài)分布的用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，3組患者年齡比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，let-7i在子宮內(nèi)膜癌、不典型增生及正常子宮內(nèi)膜組織中相對(duì)表達(dá)量的比較行Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。let-7i在子宮內(nèi)膜癌患者不同臨床和病理特征之間的表達(dá)量比較行Mann-Whitney檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 let-7i的qPCR檢測(cè)結(jié)果 本研究顯示，let-7i擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S型曲線，基線平，拐點(diǎn)清楚，各樣本間的擴(kuò)增曲線平行性好，表明其擴(kuò)增效率基本一致，擴(kuò)增滿意，見(jiàn)圖1，縱坐標(biāo)熒光強(qiáng)度是相對(duì)值，用任意單位（Arbitrary Unit，簡(jiǎn)寫(xiě)A.U）表示其單位。熔解曲線呈現(xiàn)單一峰，說(shuō)明無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生，產(chǎn)物單一，見(jiàn)圖2，縱坐標(biāo)的單位是導(dǎo)數(shù)（U/C），表示每單位溫度變化，有多少熒光強(qiáng)度改變的負(fù)變化，也是相對(duì)值。let-7i的熔解溫度（Tm）為78.3℃。子宮內(nèi)膜癌、不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織中 let-7i相對(duì)表達(dá)量分別為 0.224（0.060，0.965）、1.111（0.655，1.693）和 1.141（0.394，3.968），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=17.563，P＜0.01），子宮內(nèi)膜癌組織let-7i相對(duì)表達(dá)量低于正常子宮內(nèi)膜組織和不典型增生組織（q分別 5.808和 4.905，P＜0.01），而不典型增生與正常子宮內(nèi)膜組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.207，P＞0.05）。

圖1 let-7i的擴(kuò)增曲線

圖2 let-7i的熔解曲線

2.2 let-7i在不同臨床特征和病理特征子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá) 40例子宮內(nèi)膜癌患者中，不同年齡、病理類(lèi)型、國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期、病理分級(jí)組織中的let-7i相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），同時(shí)let-7i在是否合并高血壓、糖尿病，是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER、PR是否陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌患者中的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

miRNA是一類(lèi)小型非編碼RNA，可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。let-7家族是研究最多的miRNA之一，成員有13個(gè)，其作為抑癌基因定位在9個(gè)不同的染色體位點(diǎn)上，在多種腫瘤中表達(dá)異常，并通過(guò)對(duì)相關(guān)靶基因的調(diào)控影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]，有望成為預(yù)防腫瘤發(fā)生及血管再生的潛在治療藥物。let-7i是let-7家族的成員之一，發(fā)現(xiàn)其在胃癌[6]、卵巢癌[7]和胰腺癌[8]等多種腫瘤中表達(dá)異常，能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移或凋亡，但目前l(fā)et-7i在子宮內(nèi)膜癌中的相關(guān)研究較少。

表1 let-7i在不同臨床病理特征子宮內(nèi)膜癌患者間的表達(dá)M（P25，P75）

本研究運(yùn)用poly（A）-RT-qPCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織中l(wèi)et-7i的表達(dá)量低于正常子宮內(nèi)膜組織（P＜0.01），表明let-7i可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)let-7i在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)低于不典型增生組織，進(jìn)一步表明let-7i可能參與了子宮內(nèi)膜癌形成的早期事件。let-7i在不同手術(shù)病理分期、病理分級(jí)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)相似，提示其可能沒(méi)有參與子宮內(nèi)膜癌的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程。ER、PR在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，子宮內(nèi)膜癌組織中存在ER、PR表達(dá)下降現(xiàn)象[9]，本研究均未發(fā)現(xiàn)ER陽(yáng)性、陰性及PR陽(yáng)性、陰性的子宮內(nèi)膜癌患者中l(wèi)et-7i表達(dá)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示let-7i與ER、PR在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病過(guò)程中所起的作用可能不同。因此，筆者認(rèn)為let-7i可嘗試用于子宮內(nèi)膜癌的預(yù)防、早期診斷及基因治療。

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