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        金屬硫蛋白的檢測方法研究進(jìn)展

        2015-02-11 09:23:10劉璐劉慧萍陳伶利劉俐向琴李玲朱應(yīng)武
        應(yīng)用化工 2015年9期
        關(guān)鍵詞:免疫吸附結(jié)合法分析法

        劉璐,劉慧萍,陳伶利,劉俐,向琴,李玲,朱應(yīng)武

        (湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 410208)

        金屬硫蛋白(MTs),是廣泛存在于生物體中,具有低分子質(zhì)量(1 ~10 kD)、富含半胱氨酸(20% ~30%)、缺乏芳香族氨基酸的一類金屬結(jié)合蛋白質(zhì)[1-4]。1957 年,Margoshoes 等[5]首次報(bào)道從馬腎中分離得到Cd-MT,此后,MTs 便成為基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,研究內(nèi)容涉及生物體微量元素的儲存、運(yùn)輸和代謝,重金屬的解毒、清除自由基和參與應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)功能的關(guān)系還有與疾病的關(guān)系等各方面。近年來,人們對其進(jìn)行了廣泛而深入的研究,生物化學(xué)領(lǐng)域國際權(quán)威叢書都已開辟了金屬硫蛋白這一專欄。目前,MTs 在生物學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)保健領(lǐng)域、轉(zhuǎn)基因工程領(lǐng)域、環(huán)境檢測標(biāo)志物和疾病防治等應(yīng)用的研究顯示了誘人的前景。因此,盡快尋找一種能準(zhǔn)確、快速的檢測金屬硫蛋白的方法,從而更加深入的對其進(jìn)行研究,使其能夠發(fā)揮更大的作用顯得十分必要。迄今為止許多研究者先后應(yīng)用和發(fā)展了關(guān)于檢測MTs 的技術(shù),主要有金屬結(jié)合法、電化學(xué)分析法、蛋白質(zhì)分析法、色譜、光譜分析法等。本文重點(diǎn)闡述目前對MTs 檢測方法的研究進(jìn)展。

        1 金屬結(jié)合法

        金屬結(jié)合法是利用MTs 對金屬具有高親合力的特點(diǎn),通過其對不同金屬親合力的差異性以及其熱穩(wěn)定性而建立的檢測方法。要計(jì)算MTs 的含量,關(guān)鍵是通過測定與MTs 結(jié)合的金屬及競爭性替換金屬的含量來檢測MTs。

        1973 年,Piotrowski 等[6]基于Hg2+在酸性環(huán)境下與MTs 結(jié)合的原理,首先創(chuàng)建了測定組織中MTs的金屬結(jié)合法。該法迅速而簡便,但存在一些缺點(diǎn),如在酸性環(huán)境下可與MTs 結(jié)合,并且還可將其他金屬離子置換出來。同時(shí)此法對于203Hg 加入的用量極為苛刻,加入量過小將導(dǎo)致測定的結(jié)果偏低;加入量過大將可能會出現(xiàn)測定結(jié)果偏高。所以操作起來難以掌握,鑒于此,有專家利用層析技術(shù)改良原來方法后可檢測出100 μL 中100 nmol 的MTs。緊接著相繼出現(xiàn)Cd/血紅蛋白親和分析法、銀血紅蛋白飽和法和銀染法等。

        Cd/血紅蛋白親和分析法[7]是一種快速、靈敏、特異的評估生物樣本中MTs 含量的方法,本方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠評估大多數(shù)生物組織中MTs 含量,具有快速、周期短、靈敏、消耗少、適于大量研究,缺點(diǎn)是還存有潛在誤差,無法用于血漿或全血MTs 檢測。1995 年戴建國等用鎘飽和法測定小白鼠肝中金屬硫蛋白,該法通過口給以鋅鹽誘導(dǎo)小鼠金屬硫蛋白合成,利用鎘飽和法進(jìn)行研究,該方法有較好的重現(xiàn)性。林芃等[8]于2001 年用血紅蛋白/鎘飽和法測定魚組織中的MTs,此法測定魚組織中的MTs 濃度具有快速、靈敏、耗時(shí)少、有利于大量研究等特點(diǎn)。本方法能檢測40 ng MTs(組織濃度0.18 μg MTs/g),重復(fù)分析的RSD <均值的4%。2012 年黃偉等用血紅蛋白/鎘飽和法測定大鼠肝和血中MTs。

        銀血紅蛋白飽和法[9]主要基于Ag+與MTs 巰基團(tuán)高度親和性的特征測定組織中MTs。銀飽和法可以檢測出的MTs 來源范圍很廣。而且,體外研究證明1 mol 金屬硫蛋白能結(jié)合17 g 原子Ag,卻只能結(jié)合7 g 原子Cd。所以,Ag 飽和法可能比Cd 飽和法有更高靈敏性,也可以認(rèn)為銀飽和法測定MTs 要優(yōu)于Cd 飽和法。所以當(dāng)測量低濃度MTs 時(shí),Ag 飽和法為優(yōu)先選擇。張保林等[10]基于Ag+與MTs 的高親合力,及MTs 具有熱穩(wěn)定性的特點(diǎn)通過原子吸收光譜(AAS)測定了兔肝Zn-MT。該方法測定MTs濃度不需要去除樣品中共存的其它蛋白質(zhì),操作方便、重復(fù)性和準(zhǔn)確性好且不需特殊的儀器設(shè)備。檢測下限為1 μg/mL。

        Fuminor 等[11]用SDS-PAGE 后銀染確定MTs 的方法來檢測鎘中毒小鼠的肝臟和其它來自體外培養(yǎng)細(xì)胞的提取物中MTs。本方法通過優(yōu)化條件,使最低檢測限為ng/lane。

        金屬結(jié)合法是通過檢測金屬的含量從而間接的推算得到MTs 的含量,因此其特異性不如直接檢測的高。如:Hg 飽和法中Hg+不僅能與MTs 相結(jié)合也會結(jié)合其它一些小分子量化合物;Cd 置換不出已與MTs 結(jié)合的Ag 或Cu 等。

        2 電化學(xué)法

        電化學(xué)方法是通過測定巰基(—SH)然后計(jì)算出MTs 的濃度。巰基的測定是利用其在汞滴電極表面產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)出現(xiàn)的電位變化來實(shí)現(xiàn)。

        因?yàn)榻饘俳Y(jié)合法具有特異性較差的缺點(diǎn),因此在1979 年Olafson 等[12]建立了不受分子中金屬含量影響的方法,此法使用示差脈沖極譜法測定MTs其檢出下限是10-8mol/L。該法的優(yōu)點(diǎn)是能夠特異地反映出MTs 的量而不是金屬的量,但缺陷是容易受樣品中具有還原性物質(zhì)的干擾。

        Bordin 等能快捷地分析出還原型的MTs 并利用示差脈沖極譜法可以非常方便地檢測出樣品中多種形式的MTs,本方法通過改變檢測體系中的pH值而達(dá)到目的。

        Bebianno[13]于1992 年 檢 測 了 貽 貝 組 織 中 的MTs 的含量,應(yīng)用差分微分脈沖極譜法測定。鐵峰等[14]應(yīng)用線掃極譜法快速測定魚組織中的金屬硫蛋白。此法分離方法比傳統(tǒng)方法簡單省時(shí),適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)模分離純化。褚德瑩等利用線伏安法通過測定生物組織中金屬硫蛋白的巰基在鈷氨溶液中的催化氫波測定金屬硫蛋白的含量。2001 年,李明春等[15]在酵母菌類金屬硫蛋白的分離純化及性質(zhì)鑒定中采用組織化學(xué)的方法,使用DTNB 檢測巰基濃度。2003 年,Hourch 等在采用雙波陰極溶出伏銨法測定了MTs 其檢測下限為6 ×10-12mol/L。本方法靈敏度高,用于組織和體液中MTs 的測定。2006年,Nunez 等采用示差脈沖極譜法對水生物體中MTs 的測定。檢測范圍為0 ~25 mg/g dw。2008年,Almroth 等采用示差脈沖極譜法測定MTs,其檢測范圍為1 ~10 mg/g pr。

        3 蛋白質(zhì)分析法(免疫法)

        蛋白質(zhì)分析法(免疫法)通過蛋白質(zhì)含量測定來計(jì)算MTs 濃度,免疫法具有靈敏(靈敏度在pg/mL級)、特異等特點(diǎn),因此適用于微量檢測。近年來建立了放射免疫分析法(RIA)、競爭性酶聯(lián)免疫吸附分析法(CELISA)和酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)等用于MTs 的檢測。

        1979 年,Mallie 等最先建立檢測了大鼠血清中的MTs 濃度的方法是利用RIA 技術(shù),此方法檢測范圍為0.1 ~100 ng/mL。1990 年,Mulder 等建立應(yīng)用RIA 技術(shù)檢測人體液MTs 濃度的方法,本方法因抗體來源和特性不同將導(dǎo)致結(jié)果不同,具有高度特異性。但本方法使用了放射性同位素,具有放射性污染且需要使用昂貴的專用儀器測量。1986 年,Thomas 等首先建立了快速、不需要接觸放射性同位素且靈敏度可達(dá)100 pg/mL 的酶聯(lián)免疫吸附分析法測定MTs 含量,此法結(jié)果與放射免疫分析法相似,但比放射免疫分析法相對迅速、成本低和安全。

        1995 年,Akintola 等[16]通過酶聯(lián)免疫吸附分析法測定人血漿和尿液中MTs 濃度,此方法的靈敏度為5.0 ng/mL。Van 等[17]建立的ELISA 可檢測出60 pg 的人胎肝的MTs,并且發(fā)現(xiàn)抗體的特異性與MTs 所含的金屬離子種類有關(guān)系。還有學(xué)者[18]建立ELISA 來檢測不同亞型的MTs 是通過合成某一段特異的肽鏈,或者免疫動物制備表位特異性抗體。Margarita 等[19]開發(fā)出以辣根過氧化物酶(HRPO)標(biāo)記的MTs 作為共軛物和兔IgG 的高滴度多克隆抗體檢測人血清中MTs 含量的一種新的靈敏的競爭性ELISA 系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以有效測定MTs 的范圍為10 ~2 000 000 pg/mL,檢測下限(0.5 pg/well)因此,此方法不僅能夠用于檢測生物材料中MTs 的濃度,而且還能夠研究MTs 含量的微小偏差。1999年,鄭軍恒等[20]建立了兩種酶聯(lián)免疫吸附分析法,并成功運(yùn)用于血液MTs 濃度的測定。直接型酶聯(lián)免疫吸附分析法(檢測范圍1 ~10 ng)和競爭型酶聯(lián)免疫吸附分析法(檢測范圍50 ~500 ng)可分別運(yùn)用于較純的樣品和較粗的樣品中MTs 的濃度的檢測。張亨山等[21]于1997 年建立利用單克隆抗體為二種能識別不同抗原決定簇的兔肝MT2的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法。本方法有較好的靈敏性(靈敏度為20. 0 ng/mL)和可靠性。且運(yùn)用于人MTs 濃度的檢測。黃波等[22]于2000 年利用生物素-親和素系統(tǒng)建立的競爭型酶聯(lián)免疫吸附分析法,其系統(tǒng)提高了方法的靈敏度(檢測下限:2.5 ng/mL)并可用于檢測人體尿液中MTs 的含量。此方法操作內(nèi)和操作間的變異系數(shù)分別為2.25%和1.19%,回收率為97.6% ~100.0%,說明此方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。2009 年,Meistertzheim 等建立了ELISA 方法測定牡蠣中MTs 含量,檢測范圍為0. 01 ~0. 5 mg/g。2010 年,賈連群等[23]改進(jìn)了競爭型ELISA 檢測人尿MTs 含量的方法,通過分離純化成人肝臟金屬硫蛋白來制備抗金屬硫蛋白單克隆抗體。在應(yīng)用中此方法有較好的精確度和準(zhǔn)確度。

        免疫檢測方法的不足之處為:其中有些方法存在交叉反應(yīng)、需要接觸放射性同位素,操作不方便,還有學(xué)者[24]認(rèn)為MTs 具有大量的二硫鍵,其特性容易被氧化,使其免疫性被改變,進(jìn)而將影響蛋白質(zhì)分析法的測定結(jié)果。

        4 色譜、光譜分析法

        Hunziker 等[25]利用原子吸收光譜法來測定樣品的金屬含量,從而檢測出MTs 的濃度。該法使用RPHPLC 從兔組織樣品中分離出的7 種亞型作為樣品。Suzuki 等可在1 h 內(nèi)檢測出濃度<1 μg/mL 的1 mL 上柱樣品中的MTs 含量,并可以測定不同型的MTs。本方法可以避免常規(guī)色譜層析法的分辨力差并且洗脫費(fèi)時(shí)的缺陷。Jin 等[26]利用高效液相色譜法分離MTs,該法的靈敏度<1 μg/mL,本方法直接對MTs 的定量檢測是基于樣品對紫外吸收的特性。2008 年,Jebali 等[27]通過Cu、Cd 和Hg 誘導(dǎo)肝臟中的MTs,利用RP-HPLC-FD 測定。該方法比用分光光度計(jì)檢測靈敏度高,特異性好。2013 年,薛金花等[2]通過左氧氟沙星-鈀作為熒光探針利用共振散射法檢測MTs 濃度并成功應(yīng)用于人尿液中的檢測。2012 年,劉璐等[1,28]通過環(huán)丙沙星-銅配合物利用紫外分光光度法檢測MTs 濃度。第二年,他們團(tuán)隊(duì)利用其配合物使用熒光分光光度法、共振散射法分別測定人尿液中MTs 濃度,并比較兩種方法。2014 年錢秋梅等[3]基于8-羥基喹啉-5-磺酸(HQS)-鎘配合物通過熒光猝滅法檢測尿液中MTs 濃度。檢出限為9.36 ×10-9mol/L。

        以上所述的各種方法均具備各自的優(yōu)缺點(diǎn),對于組織器官中的MTs 的含量、體液中的MTs 含量(正常人血清和尿的MTs 含量一般不超過2 ng/mL和10 ng/mL)或MTs 含量較低的樣品、MTs 含量相對較高的樣品及MTs 的同分異構(gòu)體則分別可利用HPLC-AAS 法和血紅蛋白飽和法、RIA 和ELISA 等免疫法、金屬結(jié)合法以及HPLC 法進(jìn)行檢測。當(dāng)然,檢測方法的測定結(jié)果還可能會受到如樣品處理方法、MTs 結(jié)合金屬的種類以及自身具有的廣泛性特點(diǎn)和生物作用多樣性特點(diǎn)等[29-30]因素的影響??傊?,對于它的定量的方法仍然是多種多樣,并且這些方法還都存在著一定的缺陷,目前為止依然沒有找到一種定量檢測MTs 的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)方法[31]。近年來,隨著MTs 的深入研究發(fā)現(xiàn)其具有很大的開發(fā)潛力和無法估量的價(jià)值。將MTs 產(chǎn)業(yè)化成為必然,可目前卻存在相當(dāng)大的問題,因?yàn)樯形窗l(fā)現(xiàn)一種簡便快捷、靈敏高且適用于產(chǎn)業(yè)化的綜合監(jiān)測技術(shù)。因此,當(dāng)前急需建立檢測MTs 的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),而解決此問題也將會成為研究MTs 的重點(diǎn)攻關(guān)問題。

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