張虞婷，丁蘇蘇，李倚云*

(1.揚州市食品藥品檢驗檢測中心，揚州 225009； 2.揚州市職業(yè)大學，揚州 225009)

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細菌內毒素的研究進展及其檢查法的應用

張虞婷1,2，丁蘇蘇1，李倚云1*

(1.揚州市食品藥品檢驗檢測中心，揚州 225009； 2.揚州市職業(yè)大學，揚州 225009)

本文通過查閱相關文獻，分析和總結了細菌內毒素的起源、化學結構、生物活性及其毒性反應，就其檢查法的應用進行了三點介紹。細菌內毒素在科學檢驗與研究中有重要意義，應進一步加強細菌內毒素及其檢查法的研究，將其更好地應用于科學檢驗與研究。

細菌內毒素，鱟試劑，檢查法

近年來，隨著科學研究的深入，細菌內毒素在科學檢驗和研究中的應用越來越廣泛。為了更好地了解和應用細菌內毒素，本文就細菌內毒素的研究進展及其檢查法的應用進行綜述。

1 細菌內毒素的研究進展

細菌內毒素是革蘭陰性菌細胞壁外層上的特有成分，廣泛分布于自然界中。通常革蘭陰性菌細胞壁的外層由脂多糖(LPS)、外膜蛋白質、磷脂質以及金屬離子所組成。一般細菌在正常狀態(tài)下不釋放細菌內毒素，只有當細菌死亡、自溶、繁殖或者黏附在其他細胞時，才表現出毒性[1]。

1.1 細菌內毒素的起源 1890 年，科學家在研究發(fā)熱物質過程中，提出了細菌內毒素的概念。1933年，Boivin 等首次采用三氯醋酸自小鼠傷寒桿菌內提取出細菌內毒素，并進行免疫學的研究。因為其蛋白質反應呈現陰性，所以稱其為脂多糖(LPS)。之后陸續(xù)有學者采用各種方法從不同的革蘭陰性菌里提取出與 LPS 相似的物質，此物質有多種毒性反應。為了與外毒素區(qū)別，稱之為內毒素[2]。1940 年，Morgan 使用志賀氏痢疾桿菌，闡明了細菌內毒素是一種由脂多糖、脂質及蛋白質三部分所組成的復合體[3]。到 20 世紀中期，隨著免疫學、生物學、遺傳學、物理化學等各類相關學科的進步和發(fā)展，細菌內毒素研究工作的深入，特別是其化學結構組成和各種生物活性間的關系方面，都更加明確起來。

1.2 細菌內毒素的化學結構 細菌內毒素是一種由 LPS、蛋白質和磷脂組成的復合物，分子量約1×106～20×106道爾頓。細菌內毒素與菌體細胞壁密切相連，其活性成分是 LPS，另外兩個組成成分蛋白質和磷脂與其活性無關。LPS 也是一種結構多樣的大分子復合物，有抗原性、毒性等特性。其由多糖O抗原、核心多糖和類脂A(Lipid A)三個部分組成。

類脂 A 是 LPS 活性成分中不可缺少的部分，被視為 LPS 的“生物活性中心”，是抗原活性部位，保存著 LPS 的各種生物學活性。所以 Kasal 等認為游離類脂 A 也是一種內毒素[2]。類脂 A 位于最外層；多糖抗原向外，其由若干個低聚糖的重復單位組成的多糖鏈，具有特異性；核心多糖分為內核心和外核心；外核心由數種己糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等組成；內核心含有庚糖及特殊的 KDO(3-脫氧-D-甘露醇-辛酮糖)，KDO 以不耐酸的酮糖鍵與類脂 A 的氨基葡萄糖連接，所有革蘭陰性菌都有此結構。類脂 A 是以脂化的葡萄糖氨二糖為單位，通過焦磷酸酯鍵組成的一種獨特的糖脂化合物，具有致熱作用，是革蘭陰性細菌內毒素的活性成分。類脂 A 具有免疫原性，注入動物體內可以產生相應抗體。類脂 A 的生物學活性主要在于其以酯鍵相連的脂肪酸，若其被水解，類脂 A 或 LPS 即失去活性[4，5]。

1.3 細菌內毒素的生物活性 類脂 A 作為內毒素生物活性的主要部分，也是近年來研究報道最多的。其是由氨基葡萄糖、磷酸及10～18個碳的長鏈脂肪酸組成。類脂A與可溶性的O-特異性鏈及核心分離后，會難溶于水。游離后的類脂 A ，自身可以凝聚成高分子復合體，復合體的分子量大小不等。同時，其還含有疏水性的中心及親水性的邊沿。這既是一種雙相分子，又是酸堿兩性分子。所以類脂 A 的獨特結構使細菌內毒素具有多種生物活性[6,7]。

細菌內毒素的生物活性有很多，主要表現在如下幾個方面[8，9]：① 肌體水平：致熱性導致發(fā)熱反應[10]、致死性毒性、體質量下降、白細胞和血小板減少、降低血壓導致休克、激活凝血系統(tǒng)使血管內凝固、誘導對內毒素的耐受性和抗感染的特異性抵抗力。②細胞水平：活化巨噬細胞、刺激淋巴細胞有絲分裂、產生抗前列腺素以及使腫瘤細胞壞死的作用。③分子水平：活化補體和纖維蛋白溶酶原及鱟細胞溶解物(鱟試劑)凝集。

1.4 細菌內毒素的毒性反應 細菌內毒素由于其特殊的生物活性，會對肌體產生毒性反應[11]。

1.4.1 發(fā)熱反應 人體對細菌內毒素極為敏感。極微量(1～5 ng/kg)內毒素就能引起體溫上升，且發(fā)熱反應持續(xù)約 4 h后，才能逐漸消退[12]。人體自然感染時，因為革蘭陰性菌會不斷生長繁殖，而且同時會伴有細菌陸續(xù)死亡，并釋出內毒素，所以發(fā)熱反應將持續(xù)至體內病原菌完全消滅為止。內毒素引起發(fā)熱反應的原因是內毒素作用于體內的巨噬細胞，使其產生白細胞介素1、6和腫瘤壞死因子-α等細胞因子[13]，這些細胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱。

1.4.2 白細胞反應 細菌內毒素進入宿主體內以后，由于細胞發(fā)生移動并黏附到組織毛細血管上，血流中占白細胞總數60%～70%的中性粒細胞數量迅速減少。但在1～2 h后，由內毒素誘生的中性細胞釋放因子刺激骨髓釋放其中的中性粒細胞進入血流，使其數量顯著增加，有部分不成熟的中性粒細胞也被釋放出來[14]。革蘭陰性菌的傷寒沙門菌是例外，其內毒素使白細胞總數始終是減少狀態(tài)，目前還不清楚是什么原因。由于絕大多數被革蘭陰性菌感染的患者血流中白細胞總數都會增加，所以醫(yī)生在診斷前，為了初步區(qū)別是細菌性感染還是病毒性感染，常常要檢驗病人的血液，對白細胞進行總數測定和分類計數[15]。被病毒感染的病人，其白細胞總數和中性粒細胞百分比基本在正常值范圍內。

1.4.3 內毒素休克 當病灶或血流中革蘭陰性病原菌大量死亡，釋放出來的大量內毒素進入血液時，可發(fā)生內毒素血癥。大量內毒素作用于肌體的巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞、血小板，以及補體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等，便會產生白細胞介素1、6、8和腫瘤壞死因子-α、組胺、5-羥色胺、前列腺素、激肽等生物活性物質。這些物質作用于小血管造成功能紊亂而導致微循環(huán)障礙，臨床表現為微循環(huán)衰竭、低血壓、缺氧、酸中毒等，于是導致病人休克，這種病理反應叫做內毒素休克[16]。

在有效的抗菌治療后，由于血中細菌大量死亡崩解，可加重內毒素血癥。因此，在臨床上可能出現感染已控制而以器官損害為特點的病情繼續(xù)惡化的情況，此時需要抗內毒素治療。

大量的動物實驗及臨床實踐表明，內毒素可造成人及動物多系統(tǒng)的多種疾病，其中包括肺損傷、肝損傷、腸損傷、腎損傷及彌漫性血管內凝血、感染性休克、酸中毒及全身多功能臟器衰竭[17]。

2 細菌內毒素檢查法的應用

隨著對內毒素生物學功能研究的深入，發(fā)現血循環(huán)中的內毒素與肌體多種疾病的發(fā)生有關，因此內毒素檢測在臨床醫(yī)學、藥學及生命科學的相關研究中有非常重要的作用。

現在細菌內毒素最常用的檢查法一般是鱟試劑試驗法， 1964年由美國學者Levin和Bang發(fā)現微量革蘭陰性菌內毒素也可以引起凝膠反應，從而在1968年創(chuàng)立了一種定性或定量檢測微量細菌內毒素的體外分析方法(鱟試劑檢測法)[18]。由于其靈敏度高、特異性強而且操作簡便、快捷，目前在許多領域得到了突飛猛進的發(fā)展。從此方法建立以來，各國科研人員在細菌內毒素的本質和方法學方面的研究不斷深入和發(fā)展，加之各種新型儀器的開發(fā)，其應用已深入到藥學、醫(yī)學、微生物學以及臨床檢驗等各個領域。

1980 年，《美國藥典》第20版首先收載鱟試劑法作為細菌內毒素檢查法，隨后歐洲、日本藥局等各方也相繼收載了這一方法。1995 年，《中國藥典》 1995 版二部附錄收載了修訂后的細菌內毒素檢查法[15]。2003 年，對細菌內毒素定量檢測開始在我國臨床全面開展應用?，F在細菌內毒素檢查法作為替代注射劑熱原檢查的一種新試驗方法，不僅在試驗方法上越來越統(tǒng)一和協(xié)調，而且在檢驗品種數量上也是逐年遞增。由此可見，用細菌內毒素檢查法(鱟試劑法)替代熱原檢查是一種趨勢。隨著研究的不斷深入，細菌內毒素檢查法的應用也越來越廣泛。

2.1 在臨床的應用 體液內毒素水平是監(jiān)測和診斷嚴重細菌性炎癥反應(尤其是革蘭陰性菌)的一個重要特異性指標[19]。內毒素水平的檢測在臨床上主要有如下幾種應用[20]：① 監(jiān)控具有感染危險的患者，尤其在對于ICU病區(qū)感染性疾病患者的治療中，及早進行細菌內毒素檢測，有助于臨床的及早診斷和治療，有很高的臨床意義[21]；② 細菌性炎性疾病的鑒別診斷[22]；③ 監(jiān)控病程和防御膿毒血癥；④ 原因不明的發(fā)熱和敗血癥預測性指標[23]； ⑤ 血液透析液的檢測：血液透析液是尿毒癥患者得以生存的基礎，所以為了保證血液透析液的質量，檢查其中的內毒素對于保證臨床上的治療效果和患者的安全有著至關重要的作用[24，25]；⑥ 其他：細菌內毒素檢查還可用于飲用水檢測[26]、醫(yī)用的明膠檢測[27]、臨床使用的水膠體敷料檢測[28]。

2.2 藥品中的應用 主要是注射劑，也有少量固體制劑，涉及的種類包括中藥、化學藥、藥物中間體、藥用輔料等[29-35]。用細菌內毒檢查法代替熱原法也符合動物福利的3R原則，所以細菌內毒素檢查法今后的應用會越來越多。

2.3 醫(yī)療器械中的應用 主要是指輸液器、注射器以及輸血器、醫(yī)用制品等。一般常用的試驗液主要是用注射用水或生理鹽水來進行調制，但各國標準差異較大，所以對試驗液的調制條件要求也各異，一般浸提時間、浸提溫度對醫(yī)療器械的細菌內毒素的影響較大[36，37]，在實際檢測中要特別注意。

2.4 血液中細菌內毒素的測定 主要是用于肌體血液中的細菌內毒素監(jiān)測，為臨床診斷提供實驗數據。但由于血液中含有許多干擾鱟試劑試驗反應的物質(如各種蛋白酶抑制劑、內毒素結合蛋白等)[38]，因此，對這些干擾物質的除去即血液的前處理工作是極為重要的。

3 小結

細菌內毒素與人們健康生活的很多方面密切相關，檢測各種樣品中的細菌內毒素，對于藥品、醫(yī)療器械的安全以及臨床上相關疾病的早期診斷具有重要的意義。隨著免疫學、生物學等各個學科的不斷深入研究和發(fā)展，細菌內毒素的檢查法也越來越先進，但鱟試劑法中的鱟是一種珍稀動物，保護鱟資源也是義不容辭的責任，所以在細菌內毒素的檢查替代法方面也要不斷作出努力，同時要在具體實驗中不斷探索，不斷完善實驗方法，真正做到經濟和高效，人與自然的和諧。

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2015-03-17

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1006-5687(2015)05-0066-04

*通訊作者：李倚云，E-mail：343559262@qq.com。