秦霄雯，樊 超，任宏偉

(山東省計(jì)量科學(xué)研究院，山東濟(jì)南250014)

基于單質(zhì)細(xì)胞成分提取固定技術(shù)的血液分析儀校準(zhǔn)品制備工藝

秦霄雯，樊 超，任宏偉

(山東省計(jì)量科學(xué)研究院，山東濟(jì)南250014)

血液分析儀是臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)最常用的檢驗(yàn)儀器之一，其檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性關(guān)系臨床診斷結(jié)論和治療效果。實(shí)驗(yàn)室針對(duì)血液分析儀檢定校準(zhǔn)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)匱乏的現(xiàn)狀，研制了符合國家要求的血液分析儀校準(zhǔn)品。本文旨在闡述基于單質(zhì)細(xì)胞成分提取固定技術(shù)的血液分析儀校準(zhǔn)品的制備工藝，為臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域內(nèi)其它校準(zhǔn)品的制備提供參考。

血液分析儀;溯源;校準(zhǔn)品;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

0 引言

血液分析儀(又稱血細(xì)胞分析儀)用于測量血液中紅細(xì)胞(Red Blood Cell，RBC)、白細(xì)胞(White Blood Cell，WBC)、血小板(Platelet，PLT)的單位體積含量、測定血紅蛋白(Hemoglobin，HGB)的濃度，是目前臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行血常規(guī)化驗(yàn)的常用儀器。血液分析儀檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性直接關(guān)系臨床診斷結(jié)論和治療效果?！吨腥A人民共和國計(jì)量法》明確規(guī)定:血細(xì)胞分析儀屬強(qiáng)制檢定的范疇。校準(zhǔn)品是保證血液分析儀量值準(zhǔn)確可靠的有效手段，本文主要闡述基于單質(zhì)細(xì)胞成分提取固定技術(shù)的血液分析儀校準(zhǔn)品的制備工藝，為臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域內(nèi)其它校準(zhǔn)品的制備提供參考。

1 制備思路

首先，通過血液細(xì)胞基礎(chǔ)學(xué)和細(xì)胞形態(tài)計(jì)量學(xué)的研究，利用生物顯微鏡、掃描電鏡等儀器對(duì)國際校準(zhǔn)品進(jìn)行分析，確定血液分析儀校準(zhǔn)品采用與人血最類似的動(dòng)物血(又稱類人類血)替代人血作為候選物。其次，以細(xì)胞生物學(xué)特性為線索，用電腦編程仿真細(xì)胞特征，研究國內(nèi)禽類血和蹄科動(dòng)物血成分經(jīng)過技術(shù)處理后可達(dá)到的仿真效果，并與國際校準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比。最后，通過長期形態(tài)學(xué)觀察和儀器檢測，各項(xiàng)目指標(biāo)能夠相互印證，達(dá)到設(shè)計(jì)目的。

2 制備工藝

2.1 候選物、試劑與材料

主要包括:禽類血、蹄科動(dòng)物血;細(xì)胞稀釋液、細(xì)胞鞘液、溶血素、清洗劑;戊二醛，AR級(jí);甲醛，AR級(jí);多聚甲醛，AR級(jí);PBS緩沖液，pH=7.2;生物防腐劑，AR級(jí);氯化鈉，AR級(jí)。

2.2 單質(zhì)細(xì)胞成分提取與固定

2.2.1 (假)白細(xì)胞制備

(1)取材:無菌操作宰殺，取禽血用3.8%的枸櫞酸鈉抗凝，混勻。

(2)洗滌:離心去血漿，除掉PLT和WBC，再用基礎(chǔ)液－W離心洗滌后，取有核RBC，即(假)白細(xì)胞，適當(dāng)稀釋成懸液。

(3)固定:用特定的緩沖液配制適宜濃度的戊二醛固定液，按壓積細(xì)胞與固定液1:5混勻，振搖兩小時(shí)，做溶血實(shí)驗(yàn)，完全無溶血現(xiàn)象即可。用基礎(chǔ)液－W離心洗滌兩次并適當(dāng)稀釋后，放入4～8℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?有效期一年)。

2.2.2 純紅細(xì)胞制備

(1)取材:正常人的鮮(ACD抗凝)。

(2)純分:離心除去部分血漿、WBC和PLT;加基礎(chǔ)液－R離心一次;壓積紅細(xì)胞適當(dāng)稀釋成懸液，加適當(dāng)濃度高分子試劑溶液靜置或離心，吸去上層液體，可除去絕大多數(shù)WBC和PLT;用基礎(chǔ)液－R離心數(shù)次，測RBC懸液，當(dāng)WBC＜0.5× 109個(gè)/L時(shí)，表明純分效果良好。

(3)護(hù)膜(半固定):用基礎(chǔ)液－R配成適宜濃度戊二醛半固定液倍量混勻，搖勻兩小時(shí)并放置過夜，基礎(chǔ)液洗滌一次并適當(dāng)稀釋后，放入4～8℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?有效期半年)。

2.2.3 血小板制備

(1)取材:臨宰蹄科動(dòng)物時(shí)收集中段血液加抗凝劑混勻。

(2)將采集血分瓶，分別加適量基礎(chǔ)液－P，離心取富PLT血漿，儀器上測試，應(yīng)滿足WBC＜0.3×109個(gè)/L。

(3)固定:用基礎(chǔ)液－P配成適宜濃度的戊二醛固定液倍量與富PLT漿混合，搖勻兩小時(shí)并放置過夜，然后用基礎(chǔ)液－P離心洗滌1～2次并適當(dāng)稀釋后，放入4～8℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?有效期半年)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組配

(1)檢測各單質(zhì)物質(zhì)的項(xiàng)目參數(shù)。

(2)以WBC、RBC、HGB、PLT為計(jì)數(shù)項(xiàng)目，配置成高、中、低值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

(3)組配時(shí)根據(jù)細(xì)胞在單位容積內(nèi)所含濃度的關(guān)系進(jìn)行計(jì)算，確定各項(xiàng)目相應(yīng)的參數(shù)值，再在儀器上進(jìn)行分析測定，統(tǒng)計(jì)處理確定標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。

2.4 分裝方法

由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儲(chǔ)存特殊性要求，其包裝需使用無菌真空包裝以保證血細(xì)胞在負(fù)壓狀態(tài)下的穩(wěn)定性。具體而言，采用無任何添加劑的4mL的真空采血管，加入抑菌劑后動(dòng)態(tài)灌裝，每批共400瓶，每瓶罐裝量約為1.5mL。灌裝時(shí)需注意保持細(xì)胞懸液均勻以避免瓶間差發(fā)生。

2.5 保存方法

無菌操作分裝后，批內(nèi)抽樣在37℃孵育48h，觀察無細(xì)菌生長后置于2～8℃密封避光貯存，有效期6個(gè)月。開瓶后于2～8℃密封避光保存，有效期7d。

3 結(jié)語

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有準(zhǔn)確量值的測量標(biāo)準(zhǔn)，在化學(xué)測量、生物測量、物理測量、工程測量等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用的基體和成分極易發(fā)生變化、穩(wěn)定性較差。因此，與其它應(yīng)用領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制難度較大，成功率較低。血液分析儀校準(zhǔn)品制備過程中經(jīng)過了嚴(yán)格的均勻性檢驗(yàn)［1］、穩(wěn)定性檢驗(yàn)［2］，采用國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)給定的溯源方法［3］進(jìn)行定值，符合國家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的技術(shù)要求［4］，檢驗(yàn)參數(shù)涵蓋紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板和紅細(xì)胞壓積，符合臨床需求。血液分析儀校準(zhǔn)品不僅可用于校準(zhǔn)血液分析儀，也可用于測量過程中的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)，可為我國建立完善血液分析儀量值溯源體系，為保障人民生命安全提供技術(shù)支撐。

［1］秦霄雯，任宏偉.血液分析儀檢定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性評(píng)價(jià)［J］.計(jì)量技術(shù)，2010(2):49－51.

［2］任宏偉，秦霄雯.血液分析儀檢定用質(zhì)控物的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)［J］.中國計(jì)量.2009(11):77－78.

［3］JJG1006－94一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范［S］.北京:中國計(jì)量出版社，1995.

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