陶秋影，雷瑞瑞，王亞哲，韓 影，王 禎，陳 茜（河南省駐馬店市中心醫(yī)院兒內(nèi)科 463000）

支氣管哮喘病癥的成因是非常復(fù)雜的，其是多種細(xì)胞因子及多種的炎癥細(xì)胞和氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞共同作用的結(jié)果，其病變特征也較多，主要是以氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness，AHR）、可逆性氣道阻塞為主要表現(xiàn)，可引起反復(fù)的咳嗽、喘息、胸悶［1］。目前其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響因素眾多。近年來(lái)，髓系抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）一種在腫瘤免疫中研究較多，具有負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制的細(xì)胞，國(guó)外小鼠實(shí)驗(yàn)研究表明MDSCs在哮喘發(fā)病中同樣起重要調(diào)節(jié)作用［2］。1，25-（OH）2D3是維生素D3的活性代謝產(chǎn)物，目前認(rèn)為它不僅是微量元素，還是激素和免疫調(diào)節(jié)劑。體外研究證實(shí)1，25-二羥基維生素D3［1，25-（OH）2D3］能夠延緩氣道高反應(yīng)和氣道重塑的發(fā)生［3］，但是尚不清楚其作用的機(jī)制。在本研究中，主要是對(duì)哮喘小鼠氣道重塑模型進(jìn)行建立，同時(shí)在腹腔內(nèi)注射1，25-（OH）2D3，對(duì)于注射后的哮喘小鼠的氣道重塑的情況進(jìn)行觀察，觀察其改善情況及其體內(nèi)的 MDSCs變化，從而試圖了解1，25-（OH）2D3在哮喘發(fā)病中作用，為哮喘的治療尋找新的靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 30只雌性、健康、8周齡的BALB／c系小鼠，體質(zhì)量（20±3）g，于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)，許可 證 號(hào)：SCXK（鄂）2010-0007；卵 清 蛋 白 （OVA）、1，25-（OH）2D3（美國(guó)Sigma公司）；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；FITC標(biāo)記鼠抗人CD11b，PE標(biāo)記鼠抗人Gr1抗體（美國(guó)BD公司）；HE染色試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及哮喘模型的制備 將30只小鼠分成3組，每組有10只，分別是對(duì)照組、哮喘組以及1，25-（OH）2D3干預(yù)組，在實(shí)驗(yàn)前對(duì)各組的小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，時(shí)間為1周，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。哮喘組，致敏階段：在此階段將抗原混合液0.2mL，分別于第1、8、15天注射到小鼠的腹腔中，該抗原混合液包含生理鹽水和10%氫氧化鋁分別為0.05mL和0.15mL及OVA 50 μg；激發(fā)階段：該階段從第22天開(kāi)始，激發(fā)的方式是吸入1%OV，每天1次，每次持續(xù)30min，一共進(jìn)行兩周，從而實(shí)現(xiàn)哮喘

氣道模型的重塑。干預(yù)措施：在進(jìn)行霧化激發(fā)前的0.5h進(jìn)行生理鹽水的注射，注射量0.1mL。1，25-（OH）2D3干預(yù)組：混合液的注入及霧化的吸入與哮喘組相同。干預(yù)措施：在進(jìn)行霧化激發(fā)前的30min進(jìn)行1，25-（OH）2D3混合液的注射，注射量0.1mL［5］，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其的干預(yù)治療。對(duì)照組：在各個(gè)階段的操作與上述的操作相同，注射的溶液均用生理鹽水來(lái)代替相應(yīng)的混合液。

1.2.2 小鼠外周血收集 在模型制作成功以后，對(duì)各組的小鼠進(jìn)行摘眼球取血，將所采集的血液加入到有肝素的管子中。將小鼠的血樣分成3份，均進(jìn)行染色。在每1份的樣本中均加入30μL血及熒光標(biāo)記的抗Gr1和抗CD11b抗體，在室溫的環(huán)境下進(jìn)行10min的染色。同時(shí)加入100μL的紅細(xì)胞裂解液，同樣室溫下裂解10min，加入兩次1mL PBS洗兩遍后再加入0.5mL，而后通過(guò)FACS Calibur型流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 小鼠脾臟收集 在模型制作成功以后，將其處死取其脾臟。用預(yù)冷的PBS進(jìn)行洗滌后進(jìn)行研磨和過(guò)濾，而后收集細(xì)胞的懸液進(jìn)行離心處理（1 500r／min，5min）除去上清液后用15mL PBS進(jìn)行洗滌，而后加入紅細(xì)胞分解液1mL，將其置于4℃環(huán)境放置5min，繼續(xù)用10mL PBS進(jìn)行洗滌，洗滌兩次，調(diào)整細(xì)胞的體積，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)，將其分成3份進(jìn)行染色。在每份的樣本中加入1×106個(gè)細(xì)胞，而后分別加入熒光標(biāo)記的抗Gr1以及抗CD11b抗體，在4℃避光的環(huán)境下進(jìn)行15min染色，而后繼續(xù)用PBS進(jìn)行沖洗，兩遍，而后加入PBS 0.5mL，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 肺組織收集 在霧化結(jié)束后1d以內(nèi)對(duì)小鼠運(yùn)用乙醚進(jìn)行麻醉，將其在操作臺(tái)上進(jìn)行固定，使得其組織及心臟得以暴露，將其氣管剪斷取出其心臟以及右肺組織，置于甲醛溶液中，在避光的環(huán)境下放置48h以上。運(yùn)用石蠟進(jìn)行包埋，進(jìn)行切片，厚度為3μm，同時(shí)運(yùn)用HE進(jìn)行染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)方法為L(zhǎng)DS方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠造模過(guò)程中的表現(xiàn) 反復(fù)給予致敏及激發(fā)后，1，25-（OH）2D3干預(yù)組及哮喘組的小鼠均出現(xiàn)典型喘息發(fā)作，可能會(huì)出現(xiàn)呼吸困難及口鼻周發(fā)紺等狀況。進(jìn)行多次的激發(fā)，兩組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)、進(jìn)食減少，活力明顯降低，體質(zhì)量下降。然而1，25-（OH）2D3干預(yù)組哮喘的情況出現(xiàn)了明顯的減緩。對(duì)照組未出現(xiàn)明顯的不適。

2.2 病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察：哮喘組其氣管壁出現(xiàn)了增厚及受損，氣管管腔變窄，平滑肌層出現(xiàn)增厚，同時(shí)出現(xiàn)了上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞的脫落及增生，無(wú)論是支氣管還是血管周?chē)仔约?xì)胞的浸潤(rùn)都增多，這說(shuō)明分泌了大量的黏液。1，25-（OH）2D3干預(yù)組也出現(xiàn)了上述的變化，但是都有所緩解的。對(duì)照組氣管壁的結(jié)構(gòu)完整，光滑，上皮細(xì)胞較為整齊，未出現(xiàn)杯狀細(xì)胞的發(fā)生，氣道壁正常。將其支氣管壁厚度進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1，圖1。

2.3 MDSCs流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 哮喘組MDSCs較對(duì)照組、1，25-（OH）2D3干預(yù)組下降；1，25-（OH）2D3干預(yù)組 MDSCs較對(duì)照組、哮喘組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1，圖2、3。

圖1 小鼠肺組織支氣管壁HE染色（×400）

圖2 3組小鼠外周血CD11b＋Gr1＋MDSCs比例比較

圖3 3組小鼠脾臟中CD11b＋Gr1＋MDSCs比例比較

表1 3組小鼠氣道壁厚度、MDSCs比例（±s，n＝10）

表1 3組小鼠氣道壁厚度、MDSCs比例（±s，n＝10）

a：P＜0.05，與對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與哮喘組比較；PB：外周血；SP：小鼠脾臟。

組別 氣道壁厚度（μm）PBMDSCs（%）SPMDSCs（%）45.69±14.65 1.33±0.25 4.53±1.04哮喘組 158.78±17.35a0.78±0.25a 2.37±0.98a 1，25-（OH）2D3 干預(yù)組 84.75±18.19ab 3.17±0.24ab 8.74±2.49ab F 90.37 89.37 99.72 P對(duì)照組0.000 0.000 0.000

3 討 論

MDSCs是近年來(lái)在腫瘤免疫中研究較多具有一種負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制的細(xì)胞，研究證實(shí)免疫學(xué)機(jī)制在支氣管哮喘具有重要作用，許多研究發(fā)現(xiàn)MDSCs參與炎性反應(yīng)、哮喘氣道重塑。Deshane等［4］通過(guò)研究致敏小鼠，認(rèn)為 MDSCs能夠?qū)τ诜尾康难装Y及氣道的高反應(yīng)性起到非常重要的介導(dǎo)作用。Sinha等［5］通過(guò)用GR-1抗體來(lái)阻止小鼠體內(nèi) MDSCs的增殖，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)Th2轉(zhuǎn)化受到了明顯的抑制；MDSCs還可通過(guò)分泌IL-10等細(xì)胞因子使機(jī)體由Th1型免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)為對(duì)免疫耐受的Th2型［6］，由此可見(jiàn)MDSCs可通過(guò)調(diào)節(jié)Th1／Th2平衡來(lái)發(fā)揮炎性反應(yīng)，這點(diǎn)與哮喘免疫機(jī)制相吻合。本實(shí)驗(yàn)哮喘小鼠體內(nèi)MDSCs明顯低于對(duì)照組，由此可以推測(cè)MDSCs參與小鼠哮喘發(fā)病，且哮喘小鼠體內(nèi)存在MDSCs低水平狀態(tài)。

1，25-（OH）2D3是維生素 D3的活性代謝產(chǎn)物，目前認(rèn)為其不僅是微量元素，同時(shí)也存在激素及免疫的調(diào)節(jié)，但是對(duì)于其調(diào)節(jié)的特性來(lái)說(shuō)尚不是非常的清楚［7－9］。VDR介導(dǎo)在1，25-（OH）2D3的免疫學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮較大的作用。VDR與維生素D受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，維生素D受體多樣性被發(fā)現(xiàn)與以T輔助淋巴細(xì)胞發(fā)展失衡有關(guān)的免疫系統(tǒng)代謝病有關(guān)［12］。但體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，樹(shù)突狀細(xì)胞是1，25-（OH）2D3最主要作用目標(biāo)［13］，其能夠使得樹(shù)突狀細(xì)胞未成熟化，同時(shí)能夠使得IL-10和IL-12的分泌增加和降低，從而減輕哮喘炎性反應(yīng)。另外1，25-（OH）2D3可選擇性抑制Th1細(xì)胞的活性，促使Th1／Th2細(xì)胞平衡打破，偏向Th2細(xì)胞分化，減少其細(xì)胞因子的分泌，這正好與哮喘免疫機(jī)制相吻合。本實(shí)驗(yàn)向哮喘小鼠體內(nèi)干預(yù)注射1，25-（OH）2D3后，小鼠的哮喘的發(fā)作與哮喘組相比明顯的減緩，其氣管壁受損的厚度及程度也是如此，同時(shí)無(wú)論是平滑肌層增生程度還是杯狀細(xì)胞化生程度都是低于哮喘組，這說(shuō)明1，25-（OH）2D3能夠?qū)τ谙瓪獾赖难装Y起到減緩的作用。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)經(jīng)1，25-（OH）2D3干預(yù)小鼠體內(nèi) MDSCs明顯高于對(duì)照組，提示1，25-（OH）2D3可能通過(guò)上調(diào) MDSCs水平發(fā)揮其免疫抑制的作用，從而減輕哮喘氣道炎癥。

目前關(guān)于MDSCs免疫逃逸在哮喘中的機(jī)制逐漸受到重視，本研究首次測(cè)定1，25-（OH）2D3干預(yù)后哮喘小鼠體內(nèi)MDSCs的變化，推斷1，25-（OH）2D3可能通過(guò)上調(diào) MDSCs水平發(fā)揮免疫抑制的作用，為哮喘治療提供新的思路。

［1］ WHO／NHLBI workshop report.National heart lung and blood institute［S］.Global Strategy for Asthma Management and Prevention，Revised，2006.

［2］ Arora M，Poe SL，Oriss TB，et al.TLR4／MyD88＋induced CD11b＋Gr-1int F4／80＋non-migratory myeloid cells suppress Th2effector functionin the lung［J］.Mucosal Immunol，2011，4（1）：124.

［3］ Song Y，Qi H，Wu C.Effect of 1，25-（OH）2D3on passively sensitized human airway smooth muscle cells［J］.Respirol，2007，12（4）：486-494.

［4］ Deshane J，Zmijewski JW，Luther R，et al.Free radicalproducing myeloid-derived regulatory cells：potent activators and suppressors of lung inflammation and airway hyperresponsiveness［J］.Soc Muc Immunol，2011，4（5）：503-518.

［5］ Sinha P，Clements VK，Bunt SK，et al.Cross-talk between myeloid-de-rived suppressor cells and macrophages subverts tumor immunity toward a type 2response［J］.J Immunol，2007，179（2）：977-983.

［6］ Cuenca G，Delano MJ，Kelly-Scumpia KM，et al.A paradoxical role for myeloid-derived suppressor cells in sepsis and trauma［J］.Mol Med，2011，17（3／4）：281-292.

［7］ Brehm JM，Celedn JC，Soto-Quiros ME，et al.Serum vitamin D levels and markers of severity of childhood asthma in Costa Rica［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，179：765-771.

［8］ Devereux G，Lit onjua AA，Tu rner SW，et al.Maternal vitamin D in take during pregnancy and early childhood wheezing［J］.Am J Clin Nutr，2007，85：853-859.

［9］ Agrawal T，Gupta GK，Agrawal DK.Vitamin D deficiency decreases the expression of VDR and prohibitin in the lungs of mice with allergic airway inflammation［J］.Exp Mol Pathol，2012，93（1）：74-81.

［10］Geldmeyer-Hilt K，Heine G，Hartmann B，et al.1，25-dihydroxyvitamin D3impairs NF-κB activation in human naive B cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，407（4）：699-702.

［11］Chen Y，Kong J，Sun T，et al.1，25-dihydroxyvitamin D3suppresses inflammation-induced expression of plasminogen activator inhibitor-1by blocking nuclear factor-κB activation［J］.Arch Biochem Biophys，2011，507（2）：241-247.

［12］李飛，高金明.維生素D、維生素D受體與支氣管哮喘［J］.中華哮喘雜志，2010，4（1）：38-43.

［13］Dickie LJ，Church LD，Coulthard LR，et al.1，25（OH）2D3down-regulates intra-cellular Toll-like receptor 9-induced IL-6production in human monocytes［J］.Rheumatology，2010，49（8）：1466-1471.