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        茶多酚對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用*

        2015-03-04 07:55:14田夢(mèng)秋袁東杰鄭實(shí)興李慶玉石書(shū)婧徐志文
        重慶醫(yī)學(xué) 2015年29期
        關(guān)鍵詞:劑量生長(zhǎng)

        田夢(mèng)秋,袁東杰,鄭實(shí)興,李慶玉,石書(shū)婧,徐志文△

        (1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,廣西南寧530021;2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院耳鼻喉科,湖南衡陽(yáng)421002)

        鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤,高發(fā)于我國(guó)湖南、廣東和廣西等地[1]。98%屬于低分化鱗狀細(xì)胞癌,因此目前早期鼻咽癌以放射治療為主,晚期通過(guò)高強(qiáng)度放化療雖然能夠有效控制和殺滅腫瘤細(xì)胞,但放化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),也造成增殖活躍的正常組織干細(xì)胞的損傷,引起諸多毒副反應(yīng),5年生存率只有40%[2],因此安全有效的藥物治療是臨床迫切需要解決的問(wèn)題。

        研究報(bào)道,天然綠茶提取物茶多酚,已被證實(shí)有抗癌等藥理作用[3-4],對(duì)正常組織細(xì)胞沒(méi)有毒性[5],其作用通過(guò)抑制基因表達(dá)及相關(guān)酶的活性、提高機(jī)體免疫功能和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)[6],目前茶多酚抑制鼻咽癌血管生成方面的研究目前還較少。腫瘤組織微血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ),因此抗血管形成治療是控制腫瘤生長(zhǎng)非常有潛力的治療方法。本實(shí)驗(yàn)旨在研究茶多酚體內(nèi)抗鼻咽癌作用及其對(duì)血管生成的影響機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料 人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1:廣西醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。動(dòng)物:BALB/C雄性裸鼠18只,4~6周齡,體質(zhì)量(20±2)g,廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng),動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(桂)2009-0002,飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)環(huán)境中。

        1.2 藥物及儀器 茶多酚:黃褐色粉末,純度98%,購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司),小牛血清(Gibco公司),青鏈霉素雙抗溶液(Solarbio公司),胰蛋白酶(Solarbio公司),HRP 標(biāo)記GAPDH(康成公司)、兔抗VEGF(proteintech 公司),HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(聯(lián) 科 公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche公司),7300型定量PCR 儀(ABI公司),RIPA 裂解液(碧云天公司),Trizol(Invitrogen公司),PCR引物(Invitrogen公司合成),BCA 蛋白濃度測(cè)量試劑盒(碧云天公司),SDS-聚丙烯酰胺(雙螺旋公司),Tris(Sigma公司),ECL顯影液(Thermo公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 裸鼠移植瘤模型的建立與給藥 人鼻咽癌敏感細(xì)胞株HONE1,常規(guī)體外培養(yǎng),處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)胰酶消化、離心后,用無(wú)血清的RPMI1640 培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,濃度為1×107/mL,裸鼠右前腋皮下接種細(xì)胞懸液,每只0.2mL(無(wú)菌操作),接種后每天同一時(shí)間觀察,造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為瘤塊觸之質(zhì)硬且長(zhǎng)徑大于5mm。將造模成功的18只裸鼠隨機(jī)分為3組,對(duì)照組:0.1mL/10g生理鹽水;低劑量組:7.5mg/kg茶多酚;高劑量組:30.0mg/kg茶多酚,每組6 只,腹腔注射給藥,隔日1次,共7次。

        1.3.2 移植瘤生長(zhǎng)情況觀察 隔日測(cè)量裸鼠體質(zhì)量、移植瘤最長(zhǎng)徑(a)及最短徑(b),按照公式V=a×b2/2計(jì)算移植瘤體積,繪制生長(zhǎng)曲線。末次給藥第2天用頸椎脫臼法處死裸鼠,完整解剖出瘤塊,稱質(zhì)量,計(jì)算抑瘤率(IR),《現(xiàn)代腫瘤治療藥物學(xué)》[7]中抗腫瘤藥物有效的標(biāo)準(zhǔn)為抑瘤率大于30%,IR(%)=(1-治療組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量)×100%

        1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)VEGF mRNA 的表達(dá)情況 根據(jù)Trizol法提取3組裸鼠瘤組織總RNA。依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,ABI7300系統(tǒng)行熒光定量PCR 擴(kuò)增,設(shè)計(jì)反應(yīng)體系為20μL。PCR 反應(yīng)所用引物序列見(jiàn)表1,以GAPDH 作為內(nèi)參照。擴(kuò)增結(jié)束后收集溶解曲線,以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性?;虮磉_(dá)分析采用Livak(2-△△Ct)法進(jìn)行,2-△△Ct值表示目的基因mRNA 表達(dá)的差異倍數(shù),△△Ct=實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-CtGAPDH)-對(duì)照組(Ct目的基因-CtGAPDH),生理鹽水組為對(duì)照組。

        表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的引物序列

        1.3.4 Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)差異 給藥滿7次后頸椎脫臼法處死裸鼠,剝離瘤結(jié)節(jié),迅速稱質(zhì)量,取部分瘤組織RIPA 細(xì)胞裂解液提取蛋白,BCA 法測(cè)定蛋白濃度。20μg 蛋白上樣,8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠分離,轉(zhuǎn)PVDF膜,轉(zhuǎn)膜時(shí)間60 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2h,兔抗VEGF抗體4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜,HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體室溫標(biāo)記2h,1×TBST 充分洗膜后,ECL顯影液顯影,暗盒中壓片。Image J軟件分析Western blot圖片條帶吸光度,以GAPDH 為內(nèi)參照。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANNOVA),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 茶多酚對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞HONE1裸鼠移植瘤生長(zhǎng)速度的影響 裸鼠接種人鼻咽癌細(xì)胞HONE1后,于第7天18只裸鼠全部達(dá)到造模標(biāo)準(zhǔn)。相對(duì)對(duì)照組,給藥組(高、低劑量組)腫瘤生長(zhǎng)均較慢,其中高劑量組最慢,見(jiàn)圖1。

        圖1 茶多酚對(duì)人鼻咽癌HONE1裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

        2.2 茶多酚對(duì)荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤瘤重的影響 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:低劑量組平均抑瘤率為18.82%,高劑量組為47.66%,表明高劑量組茶多酚能有效抑制人鼻咽癌HONE1裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng),并呈濃度相關(guān)。而低劑量組抑瘤率為18.82%,效果不明顯,見(jiàn)表2。

        表2 茶多酚對(duì)人鼻咽癌HONE1裸鼠移植的抑瘤率(n=6)

        2.3 RT-PCR 法檢測(cè)VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)量 濃度梯度茶多酚作用裸鼠后,移植瘤內(nèi)VEGF mRNA 表達(dá)水平下調(diào),并呈濃度相關(guān),低劑量組為0.78±0.05,高劑量組為0.32±0.12。其中高劑量組下調(diào)明顯,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.4 Western blot法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)量 濃度梯度茶多酚作用裸鼠后,移植瘤內(nèi)VEGF 蛋白表達(dá)量下降。高劑量組蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

        圖2 茶多酚對(duì)人鼻咽癌HONE1裸鼠移植瘤VEGF蛋白表達(dá)量影響

        3 討 論

        茶多酚占茶葉干質(zhì)量的30% 左右,特別在綠茶中水平較多,具有不良反應(yīng)小、普遍存在、易獲取等優(yōu)勢(shì)。研究證實(shí)茶多酚能抗腫瘤、抗氧化等多種功能,潛藏巨大的實(shí)用價(jià)值,可發(fā)展為新型的抗腫瘤治療藥物。我國(guó)茶葉原材料豐富,因此茶多酚的抗腫瘤前景非??捎^。

        腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于瘤區(qū)血管豐富程度。研究發(fā)現(xiàn),實(shí)體瘤生長(zhǎng)至1 mm3以上如果沒(méi)有新生血管來(lái)提供氧和營(yíng)養(yǎng),腫瘤將停滯于休眠狀態(tài),也不發(fā)生轉(zhuǎn)移[8],因而有效抑制血管新生,切斷腫瘤血供,有望成為腫瘤靶向治療的一個(gè)新途徑[9]。VEGF是最重要的促血管生長(zhǎng)因子之[10],在血管生成過(guò)程中起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[11],可由多種腫瘤細(xì)胞分泌,是目前已知的作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子,其作用包括增加血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮增生、增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡和刺激體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移等,這些作用促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和新生血管的形成[12]。

        本課題組前期研究已證實(shí)茶多酚體外能明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖,且抑制作用呈濃度依賴關(guān)系[13]。本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)迅速,而給藥組腫瘤生長(zhǎng)緩慢,高濃度組的抑瘤率為47.66%(與對(duì)照組比較,P<0.05),提示高濃度茶多酚具有抑制人鼻咽癌細(xì)胞HONE1荷瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的作用。為了進(jìn)一步明確茶多酚抑制鼻咽癌分子機(jī)制,本研究觀察茶多酚對(duì)鼻咽癌移植瘤組織VEGF 表 達(dá) 的 作 用,熒光定量PCR及Western blot法分別觀察茶多酚作用后移植瘤VEGF 在mRNA 及蛋白水平上的表達(dá)變化,結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,茶多酚可明顯下調(diào)VEGF的mRNA 和蛋白表達(dá)水平,呈濃度依賴性,其中高劑量組變化明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此推斷,茶多酚能夠抑制鼻咽癌腫瘤生成,可能通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平抑制VEGF mRNA 表達(dá),減少VEGF 產(chǎn)物,從而抑制腫瘤血管生成等作用有關(guān)。

        綜上所述,本實(shí)驗(yàn)表明茶多酚對(duì)人鼻咽癌HONE1裸鼠皮下移植瘤具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用,為茶多酚應(yīng)用于鼻咽癌的臨床藥物治療提供依據(jù),有望減少鼻咽癌放化療不良反應(yīng),改善患者生活質(zhì)量。但這些功能在鼻咽癌的防治上仍未得到證明,是其今后在抗鼻咽癌研究的方向,由于目前缺乏完整的對(duì)茶多酚的毒理藥理學(xué)研究,并且對(duì)其組成成分沒(méi)能充分分離提純,大大限制了茶多酚研究,這也是今后研究的重點(diǎn)方向。

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