賀軍濤 張彥平 何娜 張磊 耿燕

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004）

血小板計數(shù)的準(zhǔn)確性在臨床工作中有著重要意義。當(dāng)血小板計數(shù)＜20×109／L 時，可引起較嚴(yán)重的出血，有自發(fā)出血傾向；當(dāng)血小板＜5×109／L 時，可導(dǎo)致嚴(yán)重的出血［1］。SYSMEX－XE2100 血細(xì)胞分析儀可以用兩種方法計數(shù)血小板，即“電阻抗法”和“光散射法”。臨床常用的為電阻抗法，但是電阻抗法計數(shù)血小板和紅細(xì)胞在同一通道內(nèi)，其結(jié)果易受干擾。光散射法利用散射光角度對血液成份進(jìn)行分析，能更準(zhǔn)確的分辨紅細(xì)胞和血小板，但是仍然無法準(zhǔn)確識別大血小板和血小板聚集的標(biāo)本。CellavisionDM96 可以提供清晰的數(shù)碼照片，形象的反映血小板形態(tài)、大小和分布。因此，采集了門診76 例血小板減少的不同標(biāo)本，分別采用SYSMEX－XE2100的電阻抗法、光學(xué)法和CellavisionDM96分析儀進(jìn)行檢測計數(shù)血小板，并就結(jié)果進(jìn)行對比觀察。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年12月5日至7日門診患者經(jīng)sysmex－xe2100血細(xì)胞分析儀檢測的76例血小板計數(shù)＜100×109／L的EDTA－K2抗凝靜脈血，76例標(biāo)本中包括男性31例，女性45例，年齡2～75歲，采血后2h內(nèi)完成各種檢測。采用日本希森美康公司XE－2100血細(xì)胞分析儀及其配套試劑，瑞典Cella vision DM96成像儀，日本希森美康公司sp－1000i自動化涂片染色儀及其配套試劑，質(zhì)控品為希森美康公司提供的e－check。

1.2 方法 日本希森美康公司XE－2100血細(xì)胞分析儀經(jīng)廠方校準(zhǔn)后，每天用3個濃度（高、中、低）水平原裝質(zhì)控品平進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，全部數(shù)據(jù)在控。其中低濃度質(zhì)控品血小板計數(shù)采用封閉方式用電阻抗和光學(xué)法分別檢測，CV 值均小于5%，見表1。

對76例標(biāo)本嚴(yán)格按照操作規(guī)程同時進(jìn)行電阻抗法和光學(xué)法對同一標(biāo)本進(jìn)行血小板計數(shù)。利用sp－1000i自動涂片染色儀對標(biāo)本進(jìn)行涂片染色后，將涂片放入CellavisionDM96分析儀中進(jìn)行檢測分析，通過對血小板的計數(shù)得出估算值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所測得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行配對t檢驗和相關(guān)線性回歸分析。

表1 低濃度血小板室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果Table 1 The quality control results of low value platelet laboratory

2 結(jié)果

2.1 對76例低值血小板標(biāo)本采用3種方法計數(shù)血小板的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析和線性回歸分析，其中血小板計數(shù)三種方法分是為電阻抗法（58.1±1.07）×109／L，光學(xué)法（60.01±31.06）×109／L，DM96（58.1±32.7）×109／L，電阻抗法和光學(xué)法回歸方程為y＝0.9454x＋5.3522，光學(xué)法和DM96 回歸方程為y＝0.9834x－0.9591，電阻抗法和DM96回歸方程為y＝0.966x＋2.0889，見圖1。

圖1 三種方法對血小板計數(shù)結(jié)果的相關(guān)和回歸分析Figure.1 The correlation analysis and regression analysis of the three methods of platelet count

2.2 通過Cella vision DM96對76例低值血小板計數(shù)，發(fā)現(xiàn)一例血小板聚集，造成SYSMEX－XE2100光學(xué)法和電阻抗法計數(shù)假性減低，見圖2。

3 討論

一般情況下如需判斷患者有無出血傾向及其有無止血能力，需要做血小板檢查，其中最為常見的是做血小板計數(shù)。近期有一些學(xué)者提出血小板計數(shù)在急性顱腦損傷預(yù)后中的意義［2］，血小板計數(shù)在肝硬化脾亢中的意義［3］。當(dāng)血小板低于20×109／L 時，傳統(tǒng)上認(rèn)為必須給予患者輸注血小板［4］。所以血小板計數(shù)準(zhǔn)確性尤為重要，關(guān)系到疾病的診斷和必要的治療。

圖2 DM96鏡檢發(fā)現(xiàn)大量血小板聚集Figure 2 Microscopic examination revealed a large group of platelet aggregation by Cella vision DM96

世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的血小板計數(shù)方法，容易受到充池，血小板在計數(shù)板上的分布，計數(shù)人員的主觀判斷等誤差因素影響，重復(fù)性較差且費時，已不適用于臨床工作的需求［5，6］。血小板計數(shù)的參考方法是國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會（ICSH）推薦的使用抗CD61抗體和抗CD41抗體的流式細(xì)胞術(shù)［7］。但有些人血小板表面不表達(dá)CD61，而表達(dá)CD62或CD42b，這種病人就不宜用免疫學(xué)方法檢測血小板，因免疫學(xué)方法很難在常規(guī)工作中推廣應(yīng)用。

目前大多數(shù)臨床實驗室對血小板的計數(shù)優(yōu)先采用全自動血細(xì)胞分析儀的電阻抗法和光學(xué)法。電阻抗法計數(shù)紅細(xì)胞和血小板常常在同一通道內(nèi)進(jìn)行，根據(jù)二者體積的不同，采用浮動界標(biāo)技術(shù)界定血小板和紅細(xì)胞，即血細(xì)胞分析儀在進(jìn)行血小板計數(shù)時只收集2～20fl的原始數(shù)據(jù)，利用擬合曲線技術(shù)通過對數(shù)曲線正態(tài)分布的擬合方法計算出0～2fl及20～70fl的極小血小板和大血小板的數(shù)量，進(jìn)而給出血小板的總數(shù)量。這種方法對血小板的計數(shù)受其它因素干擾較大，而且無法識別血小板聚集的情況，造成血小板的假性減低；易將小紅細(xì)胞和紅細(xì)胞碎片等作為血小板而計數(shù)，造成血小板的假性增高。

光學(xué)法對血小板的計數(shù)是通過對血小板核酸染色激光散射法。將稀釋、化學(xué)染色或核酸染色的球形化細(xì)胞懸液注入鞘流中央使單個細(xì)胞沿著懸液和鞘流兩股液流整齊排列成單行，并以恒定流速定向通過石英毛玻璃，即形成流體力學(xué)聚焦技術(shù)。當(dāng)細(xì)胞或顆粒通過檢測區(qū)被激光束照射時因其體積、染色程度、細(xì)胞內(nèi)容物大小及含量、細(xì)胞核密度等本身特性，可阻擋或改變激光束方向，產(chǎn)生與其特征相應(yīng)的不同角度的散射光，低角度散射光測定細(xì)胞大小及表面特性，高角度散射光測定細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征信息。這種方法可避免細(xì)胞重疊，利用高、低角度散射光提高對血小板的鑒別能力。但對于存在血小板聚集以及大血小板標(biāo)本，此方法無法準(zhǔn)確識別并計數(shù)血小板。

血常規(guī)儀器提示血小板聚集報警信息后，必須復(fù)查血樣，推片復(fù)檢，而傳統(tǒng)手工推片受人工和時間限制，在大量樣本面前往往沒有優(yōu)勢，DM96彌補了這一缺憾，因為CellavisionDM96系統(tǒng)由涂片掃描裝置和和裝有配套血細(xì)胞分析軟件的計算機組成。采用與血細(xì)胞分析儀的流式細(xì)胞術(shù)完全不同的技術(shù)，是一種結(jié)合傳統(tǒng)顯微鏡檢查和現(xiàn)代神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的新型細(xì)胞分析技術(shù)。血涂片裝載到該系統(tǒng)后儀器開始掃描涂片，先在10×物鏡下以城垛跟蹤方式找到血小板，再于100×物鏡下通過自動對焦進(jìn)行細(xì)胞分割和提取，拍攝數(shù)碼照片。用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析識別血小板。尤其對大血小板和血小板聚集的標(biāo)本，所提供的清晰的圖片，能夠使對該標(biāo)本的血小板減少原因和分布有更加準(zhǔn)確的分析。操作人員只需對已分類結(jié)果做屏幕檢查，客觀的完成常規(guī)形態(tài)學(xué)分析，降低了人為介入，實現(xiàn)良好重復(fù)性，在實踐時間上，大大節(jié)省了檢驗人員花費的時間，提高了工作效率［8－10］。我們通過DM96觀察血小板形態(tài)上表現(xiàn)出體積不同的增大，可能和病情或藥物治療有關(guān)。電阻抗法計數(shù)血小板（80～100）×109／L 時并有大血小板的提示時，光學(xué)法計數(shù)普遍比電阻抗法高?？赡芘c大血小板計數(shù)擬合曲線有關(guān)，造成電阻抗法血小板計數(shù)假性減低。因收集標(biāo)本有限，可以進(jìn)一步加大標(biāo)本量并且驗證正常血小板和高值血小板在CellavisionDM96上的臨床應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

電阻抗法和光學(xué)法對血小板計數(shù)有較好的一致性，這與其他報道一致［11］。對于血小板減少的標(biāo)本尤其是SYSMEX－2100檢測提示有大血小板及血小板聚集的標(biāo)本，一定要用CellavisionDM96系統(tǒng)進(jìn)行分析。以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，為臨床提供更可靠的信息。

［1］Ang DC，Marinescu L，Kuriyan M.Physician compliance with platelet usagecriteria［J］.Arch Pathol Lab Med，2008，132（8）：1321－1324.

［2］Kunicka J E，F(xiàn)icher G，Murphy J，et al.Improved platelrt counting using two－dimcnsional laser light scatter［J］.Am J Pathol，2000，114（5）；283－289.

［3］Harrison P，Horton A，Grant D，et al.Immunoplarelet counting；aproposed new reference procedure［J］.Brit J Heamat.2000，108：228－235.

［4］周振國，暢濤，等.血小板計數(shù)在急性顱腦損傷預(yù)后中的意義［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志2013，42（12）：1619－1626.

［5］任松，王佩俊，李宗芳.肝硬化脾亢血小板減少機制［J］.西部醫(yī)學(xué)雜志2013，25（11）：1745－1746.

［6］朱忠勇，等.準(zhǔn)確計數(shù)血小板方法學(xué)研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)（臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊），2002，23（3）：131－132.

［7］王建中，屈晨雪.三種流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)血小板方法的比較研究［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003，26（1）：8－12.

［8］任穎佳，王悅，劉汝峰.CellaVision DM96 血細(xì)胞形態(tài)分析儀外周血細(xì)胞分類結(jié)果評價［J］.臨床檢驗雜志2014，8（32）：568－569.

［9］楊婧，關(guān)會霞，牛景陽.CellaVision DM96自動成像系統(tǒng)在白細(xì)胞分類計數(shù)中的應(yīng)用［J］.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床雜志2014，4（7）：891－892.

［10］黃驥斌，曾婷婷，郭曼英，等.CellaVision DM96 自動化數(shù)字圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行白細(xì)胞分類的臨床應(yīng)用［J］.檢驗醫(yī)學(xué)雜志2012，27（4）：299－300.

［11］陳梅方，偉禎，傅玉如.Sysmex XE－2100 全自動血細(xì)胞分析儀對血液病血小板計數(shù)的檢測價值［J］實用醫(yī)學(xué)雜志2007，（7）：1072－1073.