任麗蓉 何藺 劉濤 王浩宇

（1.四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院心內(nèi)科，四川 南充 637000）

微血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅構(gòu)成了血液與組織間的重要屏障，參與物質(zhì)交換，同時微血管內(nèi)皮細(xì)胞還具有合成、分泌和降解生物活性物質(zhì)的功能［1］。在對內(nèi)皮細(xì)胞的不斷研究中，發(fā)現(xiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能損害是糖尿?。?］、感染［3］、纖維化［4］、休克及腫瘤等多種疾病的病理基礎(chǔ)［5］。微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能不同于大血管內(nèi)皮細(xì)胞［6］，因此在對內(nèi)皮細(xì)胞的研究中必須區(qū)分二者的差異。另外，不同的組織器官微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能具有特異性。目前國內(nèi)外已有相當(dāng)?shù)奈墨I(xiàn)報道了不同組織器官的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，但是小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（mouse cardiac microvascular endothelial cells，MCMECs）的分離培養(yǎng)方法仍不成熟。本實驗介紹一種可以避免膠原酶等消化酶的化學(xué)損傷，同時又簡單可行、重復(fù)性好且經(jīng)濟(jì)節(jié)約的小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3～4周大小的SPF 級雄性C 57小鼠，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco公司，明膠（gelatin）購自Sigma公司，內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM）購自Sciencell公司，0.25%胰蛋白酶溶液、低糖／DMEM 培養(yǎng)基和青霉素／鏈霉素混合液購自Hyclone公司，兔抗小鼠vWF 相關(guān)抗原多克隆抗體（Ⅰ抗）購自Santa Cruz，Matrigel膠購自BD 公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng) MCMECs的分離參照相關(guān)文獻(xiàn)［7，8］并改進(jìn)。將5～8只C 57小鼠脫頸法處死，全身于75%酒精溶液中浸泡3～5min后，無菌條件下逐層打開胸腔，迅速取出心臟并置于含有1%青／鏈霉素混合液和適量肝素鈉的低糖／DMEM 培養(yǎng)基中清洗干凈。將清洗干凈的小鼠心臟轉(zhuǎn)移至冰袋上盛有低糖／DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，小心去除左右心房、瓣膜組織和結(jié)締組織，將余下的心室組織用70%［9］的酒精浸泡15s，以滅活心肌內(nèi)外膜細(xì)胞。PBS 溶液徹底清洗心室組織，吸棄多余的PBS溶液后滴加少量FBS至余下的心肌組織中，然后用眼科剪快速地將其剪切為1mm×1mm×1mm 大小的組織塊。將剪碎的組織塊均勻地接種至1%明膠包被的6孔板中，將6孔板放入37℃5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育60min 使組織塊牢固貼壁后，輕輕追加2mlECM（含5%FBS＋1% 內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物ECGS＋1%青霉素／鏈酶素混合液）完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。約24小時后可見組織塊周圍有細(xì)胞爬出，48小時后第1次換液，約65小時后去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。以后每2天換液1次，大約1周后細(xì)胞匯合呈單層。

1.3.2 小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 原代MCMECs生長至6孔板底面積的80%～90%時吸棄舊培養(yǎng)基并用PBS溶液清洗6孔板3次后，每孔加入適量37℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶液，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間隙增大時立即加入含10%FBS的低糖／DMEM 培養(yǎng)基終止消化。吸管輕輕吹打6孔板底面至細(xì)胞全部脫落后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1200r／min 離心3min。去掉離心管內(nèi)液體，加入適量ECM 完全培養(yǎng)基后輕輕吹打均勻，將重懸的細(xì)胞按1∶2比例傳代至1%明膠包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時后首次換液，以后每2天換液1次。

1.3.3 小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長曲線繪制取對數(shù)生長期的第二代小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔2×104個細(xì)胞接種至明膠包被的24孔板中，從第二天開始將每3個孔作為1組進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取平均值，直到將所有組的細(xì)胞計數(shù)完畢，共8天，以細(xì)胞生長天數(shù)（d）為橫坐標(biāo)，所得的平均細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線圖。

1.3.4 小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 取第二代或第三代對數(shù)期生長的MCMECs細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，接種至盛有無菌蓋玻片的24孔板中。當(dāng)細(xì)胞爬滿蓋玻片面積的70%～80%時，用PBS溶液清洗3次，每次3min；接著用4%的多聚甲醛固定30min 后用PBS 溶液清洗3 次，每次3min；然后用0.1%的Tritionx－100室溫孵育15min，PBS洗3次，每次3min。每張細(xì)胞爬片上滴加適量的正常山羊血清室溫封閉1小時后，滴加適量兔抗小鼠vWF多克隆抗體（Ⅰ抗，1∶100）至爬片剛好被抗體覆蓋，將爬片放入濕盒中4℃過夜，PBS溶液洗3次，每次3min，滴加適量FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG（Ⅱ抗，1∶100），室溫避光孵育1小時后用PBS溶液清洗3次，每次3min，最后用DAPI染核，室溫避光孵育15min，同時做空白對照，用PBS代替Ⅰ抗，余步驟相同。用熒光抗淬滅劑封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 體外小管形成實驗 4℃冰箱融化Matrigel膠，48孔板和200μl槍頭提前預(yù)冷。按每孔100μl將Matrigel膠加至48 孔板內(nèi)，不要產(chǎn)生氣泡，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中過夜孵育使膠凝固后，按2×104個細(xì)胞每孔加入48孔板內(nèi)，細(xì)胞接種后分別于6、12、24h在倒置顯微鏡下拍照，動態(tài)觀察MCMECs的體外小管形成過程。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 組織塊貼壁后24小時開始有少量細(xì)胞爬出，成梭形、三角形或多角形（圖1A）；培養(yǎng)1周左右可匯合成單層，呈典型的鋪路石樣（圖1B）。傳至第三代后在明膠包被的培養(yǎng)皿中細(xì)胞仍呈梭形、多角形、鋪路石樣和管腔樣生長（圖1C），細(xì)胞傳至3代內(nèi)的形態(tài)和性狀未發(fā)生明顯變化。

2.2 小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長曲線 MCMECS的生長曲線近似“S”形，表現(xiàn)為傳代后的MCMECs第1、2天生長速度比較緩慢，第3、4天時生長速度增快，進(jìn)入對數(shù)生長期，第5～7天時達(dá)到匯合狀態(tài)，第7、8天細(xì)胞數(shù)量不再增加，進(jìn)入停滯期（圖2）。說明分離得到的MCMECs的生長具有潛伏期、對數(shù)生長期和接觸抑制的特性。

2.3 小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫熒光鑒定 爬片的細(xì)胞經(jīng)vWF和DAPI免疫化學(xué)染色后可見胞漿呈綠色熒光，核呈藍(lán)色熒光（圖3），說明分離培養(yǎng)的細(xì)胞陽性表達(dá)vWF，陽性染色率達(dá)90%以上，證明該實驗所獲細(xì)胞為小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

2.4 體外小管形成實驗 將MCMECs接種到Matrigel膠后6 小時可觀察到細(xì)胞已貼壁，并且細(xì)胞開始聚集形成不明顯的管腔樣結(jié)構(gòu)（圖4A），12 和24h時細(xì)胞已經(jīng)形成明顯的具有三維結(jié)構(gòu)的小管結(jié)構(gòu)，并相互交織成網(wǎng)絡(luò)狀（圖4B和C），可見分離得到的微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有小管形成能力。

圖1 MCMECs的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)（×100）Figure 1 Primary culture and subculture of MCMECs

圖2 MCMECs的生長曲線Figure 2 The growth curve of MCMEC

圖3 vWF相關(guān)抗原的免疫熒光鑒定（×400）Figure 3 Identification MCMECs by vWF

圖4 MCMECs的體外小管形成實驗（×100）Figure 4 The tube formation of MCMECs

3 討論

Nishida等［10］使用膠原酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化法成功分離出大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞后，國內(nèi)外多采用該法分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞。之后，Chen等［11］報道了另一種培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，即組織塊貼壁法，該法不僅操作簡單，還可以避免消化酶對細(xì)胞的化學(xué)損傷。后來國內(nèi)也有使用組織塊貼壁法成功培養(yǎng)出大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的報道［8，12，13］。而對于小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)，目前報道的方法主要還是采用酶消化法［14～16］。但由于小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)難度大，且尚無成熟的細(xì)胞系，因此有必要建立一種簡單有效的小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法。

組織塊貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞成功的關(guān)鍵就是使組織塊充分貼壁。本實驗方案在剪切心室肌組織時加入了少量的FBS，不僅可以營養(yǎng)心肌組織，避免組織塊干燥，且FBS還有促進(jìn)組織塊貼壁的作用；另外，培養(yǎng)細(xì)胞的6孔板和培養(yǎng)皿預(yù)先用1%的明膠包被也具有促進(jìn)組織塊貼壁的作用。組織塊貼壁后最先游離出的細(xì)胞是紅細(xì)胞，接著內(nèi)皮細(xì)胞開始游出，成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞要72小時后才開始游出［11］。據(jù)此本實驗在65 小時的時候去除組織塊，既可以使心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞充分游出，又避免了成纖維細(xì)胞的污染，并且整個培養(yǎng)過程都使用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基的血清濃度低且含內(nèi)皮細(xì)胞促生長物質(zhì)，因此該培養(yǎng)基在促進(jìn)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞游出和生長的同時，可以抑制成纖維細(xì)胞的游出和分裂增殖。由于紅細(xì)胞基本不貼壁，且無分裂增殖能力，在以后的換液和傳代過程中可逐步清除，如此可獲得較高純度的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，因為該法操作步驟簡單，流程短，還可以減少操作過程中的污染機(jī)會。

4 結(jié)論

本實驗提供了一種操作簡便、經(jīng)濟(jì)節(jié)約且細(xì)胞獲得量大、活性好、純度高的小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的成功培養(yǎng)將為微血管病變的研究提供了實驗所需的細(xì)胞來源，并可促進(jìn)心血管疾病研究的發(fā)展。

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