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        瑞舒伐他汀通過激活SGK1上調(diào)ALI小鼠ENaC表達的實驗研究*

        2015-02-09 07:50:44馮社軍王慧娟李軍濤武艷強朱濤
        西部醫(yī)學(xué) 2015年12期
        關(guān)鍵詞:肺水腫瑞舒伐肺泡

        馮社軍 王慧娟 李軍濤 武艷強 朱濤

        (1.邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056001;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸病學(xué)研究室/呼吸內(nèi)科,四川 成都 610041)

        非心源性肺水腫(non-cardiac pulmonary edema)是急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome,ARDS)最重要的病理特點之一,也是ALI/ARDS 最特征性的病理生理學(xué)改變[1~4]。臨床研究發(fā)現(xiàn),在ARDS狀態(tài)下非心源性肺水腫是導(dǎo)致肺順應(yīng)性下降和肺氧合功能障礙的主要原因之一,也是導(dǎo)致早期ARDS患者死亡的主要因素[1~4]。研究證實,改善肺水腫可以有效改善肺順應(yīng)性和肺換氣功能,降低ALI模型動物的死亡率。大量研究表明,他汀類藥物具有獨立于降脂以外的包括抑制炎癥反應(yīng)、抗腫瘤和抗凋亡等多種生物學(xué)活性[5~8]。同時發(fā)現(xiàn)他汀可以有效促進血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(SGK1)的活化[7]。由于SGK1是調(diào)節(jié)肺上皮細胞ENaC的關(guān)鍵分子,實驗表明,激活SGK1可有效上調(diào)ALI狀態(tài)下肺上皮細胞ENaC 的表達而改善肺水腫[3]。本文探討在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI狀態(tài)下,瑞舒伐他汀能否通過上調(diào)肺組織ENaC 的表達改善肺水腫的嚴重程度及相關(guān)的分子機制。

        1 材料和方法

        1.1 主要材料 SPF 級雄性C57BL/6小鼠30只,6~10周齡,體重約18~22g,購于四川大學(xué)實驗動物中心。電泳單元及電泳附件、電源、濕轉(zhuǎn)式電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像系統(tǒng)由Bio-rad公司提供。瑞舒伐他汀購于瑞典阿斯利康制藥有限公司;大腸埃稀桿菌內(nèi)毒素(LPS)購自美國Sigma公司;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;總RNA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;第一鏈cDNA 合成試劑盒和PCR 試劑盒購自美國Mbi Fermentas公司;兔抗鼠α-ENaC 抗體、兔抗鼠β-肌動蛋白(β-actin)抗體、兔抗鼠phospho-SGK1抗體以及兔抗鼠SGK1 抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

        1.2 方法

        1.2.1 LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型的建立 30 只雄性C57BL/6大鼠隨機平均分為對照組(Control組)、干預(yù)組(LPS+ROS 組)和模型組(LPS 組),每組10只。腹腔注射戊巴比妥(30mg/kg)麻醉小鼠。干預(yù)組和模型組小鼠通過氣道內(nèi)注射LPS(10μg LPS溶于50μl生理鹽水)誘導(dǎo)建立ALI模型[1]。注入LPS前2小時,干預(yù)組給予口服瑞舒伐他?。?0mg/kg),每日1次;對照組給予生理鹽水代替LPS。于干預(yù)72 小時后下腔靜脈放血處死小鼠。

        1.2.2 HE染色觀察病理變化并進行肺損傷評分取左下肺組織,常規(guī)制成5μm 的石蠟切片,HE 染色觀察肺損傷程度,并進行肺損傷評分[1]。

        1.2.3 肺組織濕/干比(wet to dry ratio,W/D)測定小鼠處死后取出肺組織。將小鼠右下肺置于80℃烤箱24 小時至恒重后,記錄前后肺組織重量,計算W/D 比值。

        1.2.4 RT-PCR 法檢測α-ENaC mRNA 表達 取左上肺組織,按照試劑盒說明書提取總RNA。引物:α-ENaC 正 義:5′-TCACTTCAGCA CATCTTC CACAGCTGC-3′,反 義:5′-GTATCTGC CTAGCTGGTC CAAGTGGGA-3′;β-actin 引 物:正 義:5′-CGAGCGGGC TACAG CTTC-′,反 義:5′-GTCACGC ACGATTC CCTCT-3′,按照試劑盒說明書介紹進行反轉(zhuǎn)錄和擴增實驗。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影,Quantity One軟件對目的條帶進行掃描分析。用α-ENaC/β-actin PCR 產(chǎn)物條帶灰度比值作為α-ENaC mRNA 的相對表達量。

        1.2.5 Western blot檢測肺組織α-ENaC 蛋白表達和SGK1活化水平 按照試劑盒操作要求,首先提取肺組織總蛋白,并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE),然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上,用脫脂奶粉封閉1小時,分別加入兔抗鼠α-ENaC抗體(1∶1000)、兔抗鼠β-actin抗體(1∶2000)、兔抗鼠phospho-SGK1抗體(1∶1100)以及兔抗鼠SGK1抗體(1∶1100),4 ℃孵育過夜,洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1000),用ECL 進行顯色,用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

        2 結(jié)果

        2.1 肺組織病理學(xué)變化和肺損傷評分 在干預(yù)72小時后,獲取小鼠肺組織,HE 染色后光鏡觀察。對照組小鼠肺組織未見病理改變,肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡間隔結(jié)構(gòu)完整,無炎癥細胞浸潤,無紅細胞進入肺泡腔,無透明膜形成;模型組小鼠肺組織出現(xiàn)嚴重的病理學(xué)改變,主要表現(xiàn)為肺泡間隔增厚,肺組織中大量炎癥細胞浸潤,肺泡和肺間質(zhì)大量水腫液聚集,肺泡腔中出現(xiàn)大量紅細胞,肺泡中透明膜形成;干預(yù)組小鼠肺組織病理改變相對較輕,主要表現(xiàn)為肺泡和肺泡間隔內(nèi)輕度炎癥細胞浸潤,肺間質(zhì)性肺水腫形成,僅部分肺泡內(nèi)出現(xiàn)水腫液聚集和紅細胞,并可見少量透明膜。進行肺損傷評分后發(fā)現(xiàn),LPS組小鼠肺組織損傷評分高于干預(yù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1、表1。

        表1 小鼠肺組織損傷評分和W/D值()Table 1 Lung injury scores and W/D ratio in mice

        注:與對照組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05

        2.2 肺組織濕干比(W/D 比值)在干預(yù)72小時后,LPS干預(yù)小鼠肺組織W/D 比值較對照組明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但干預(yù)組小鼠肺組織的W/D 比值較模型組更低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

        2.3 肺組織α-ENaC 的表達水平 使用RT-PCR 和western blot對肺組織中α-ENaC mRNA 和蛋白表達分析后發(fā)現(xiàn),在LPS干預(yù)72小時后小鼠肺組織中α-ENaC mRNA 和蛋白表達量較對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。但瑞舒伐他汀干預(yù)組小鼠肺組織α-ENaC表達量較模型組小鼠升高,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2、表2。

        圖2 肺組織α-ENaC表達RT-PCR和western blotting結(jié)果Figure 2 The RT-PCR and western blot results ofα-ENaC in each group

        表2 肺組織α-ENaC mRNA 和蛋白的表達水平及SGK1的活化水平()Table 2 The mRNA and protein expression ofα-ENaC and the activity of SGK1in the lung tissues

        表2 肺組織α-ENaC mRNA 和蛋白的表達水平及SGK1的活化水平()Table 2 The mRNA and protein expression ofα-ENaC and the activity of SGK1in the lung tissues

        注:與對照組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05

        2.4 肺組織SGK1活化水平 使用western blot對肺組織中SGK1 活化水平(phospho-SGK1/total SGK1)分析后發(fā)現(xiàn),在LPS干預(yù)72小時后小鼠肺組織中SGK1活化水平較對照組明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但瑞舒伐他汀干預(yù)組小鼠肺組織SGK1活化水平較模型組升高,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3、表2。

        圖3 肺組織SGK1活化水平結(jié)果Figure 3 The activity of SGK1results in lungs

        3 討論

        急性肺損傷(ALI)是一種由多種嚴重的肺內(nèi)或肺外疾病,如重癥肺炎、肺膿腫、嚴重膿毒血癥和休克等導(dǎo)致的失控和自我放大的、以肺組織為中心的炎癥反應(yīng)[1~4,9]。急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)是其更加嚴重的狀態(tài)。目前流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究結(jié)果表明,ARDS的病死率高達35%~50%,尋求新的治療方法和藥物具有重要的價值和意義[4]。非心源性肺水腫(non-cardiac pulmonary edema)是ALI/ARDS 最重要的病理改變之一,也是ALI/ARDS 最特征性的病理生理改變[1~4,9]。臨床研究發(fā)現(xiàn),非心源性肺水腫是導(dǎo)致肺順應(yīng)性下降和肺氧合功能障礙的主要原因之一,也是導(dǎo)致早期ARDS 患者死亡的主要因素[1~4,9]。研究證實,改善肺水腫可以有效改善肺順應(yīng)性和肺換氣功能,降低ALI 模型動物的死亡率[1~4,9]。

        研究發(fā)現(xiàn),他汀類(statin)藥物包括瑞舒伐他汀(rosuvastatin)和辛伐他?。╯imvastatin)等具有獨立于降脂以外的包括抑制炎癥反應(yīng)、抗腫瘤和抗凋亡等多種生物學(xué)活性[5~8,10]。Zhu T 等研究證實,瑞舒伐他汀可以通過抑制炎癥反應(yīng)下調(diào)OVA 誘導(dǎo)的小鼠氣道粘液的分泌[6]。Duivenvoorden R 等的研究發(fā)現(xiàn),他汀對動脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥反應(yīng)有明顯地抑制作用[10]。我們的實驗表明,LPS誘導(dǎo)72小時后小鼠肺組織出現(xiàn)顯著的病理學(xué)改變,主要表現(xiàn)為肺泡間隔增厚,肺組織中大量炎癥細胞浸潤,肺泡和肺間質(zhì)大量水腫液聚集,肺泡腔中出現(xiàn)大量紅細胞,肺泡中透明膜形成。而瑞舒伐他汀進行干預(yù)后,小鼠肺組織病理改變明顯減輕,主要表現(xiàn)為肺泡和肺泡間隔內(nèi)輕度炎癥細胞浸潤,肺間質(zhì)性肺水腫形成,僅部分肺泡內(nèi)出現(xiàn)水腫液聚集和紅細胞,并可見少量透明膜。進一步肺損傷評分后發(fā)現(xiàn),干預(yù)組小鼠肺組織損傷評分顯著低于LPS組。對肺水腫嚴重程度進行分析后也發(fā)現(xiàn),LPS干預(yù)后小鼠肺組織W/D 比值較對照組明顯增加,但瑞舒伐他汀干預(yù)后小鼠肺組織的W/D 比值較模型組更低。以上結(jié)果表明,瑞舒伐他汀可以明顯減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型肺組織炎癥反應(yīng)和肺水腫。

        進一步的研究發(fā)現(xiàn)[3,9,11],肺水腫的形成和清除與肺上皮細胞表達的鈉離子通道(ENaC)密切相關(guān),ENaC是肺泡液體清除的關(guān)鍵和限速環(huán)節(jié),其表達和功能的異常是導(dǎo)致ARDS非心源性肺水腫的重要原因。ENaC由α、β和γ3種亞基構(gòu)成,ENaC 在肺泡I型和II型上皮細胞上廣泛表達,而α亞基是ENaC 的功能亞基,β和γ 亞基對ENaC 活性具有調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn),在LPS干預(yù)72小時后,小鼠肺組織中α-ENaC mRNA 和蛋白的表達量明顯下降,但瑞舒伐他汀干預(yù)組小鼠肺組織α-ENaC表達量較模型組小鼠升高,提示在ALI狀態(tài)下,瑞舒伐他汀能夠通過促進ENaC的表達改善肺水腫。

        另有研究證實,SGK1 是調(diào)節(jié)肺上皮細胞ENaC表達的關(guān)鍵分子,促進SGK1 磷酸化(即SGK1 的活化)對于調(diào)節(jié)ENaC 的表達具有重要作用[12]。Zhu T等的研究表明,LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠模型中促進SGK1磷酸化可以通過上調(diào)肺組織中ENaC 以減輕肺水腫的嚴重程度[3]。Zhang L 等研究表明,他汀類藥物也可誘導(dǎo)SGK1 磷酸化的發(fā)生[7]。本實驗中我們使用western blot法對SGK1 的活化水平(phospho-SGK1/total SGK1)進行分析后發(fā)現(xiàn),在LPS干預(yù)72小時后小鼠肺組織中SGK1活化水平較對照組明顯下降,但給予瑞舒伐他汀干預(yù)的小鼠肺組織SGK1活化水平較模型組小鼠升高。提示在ALI狀態(tài)下,瑞舒伐他汀可以誘導(dǎo)肺組織中SGK1的活化。

        4 結(jié)論

        本研究結(jié)果表明,在LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI狀態(tài)下,瑞舒伐他汀可以通過增加肺組織ENaC 的表達有效地改善肺水腫嚴重程度,并發(fā)現(xiàn)該機制與促進SGK1的活化密切相關(guān)。這為他汀類藥物應(yīng)用于ARDS的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

        [1]Zhu T,Wang D,Zhang W,et al.Andrographolide protects against LPS-induced acute lung injury by inactivation of NF-κB[J].PloS one,2013,8(2):56407.

        [2]朱濤,肖敏,文富強,等.脫氫穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯上調(diào)水通道蛋白5減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷肺水腫的實驗研究[J].西部醫(yī)學(xué),2014,26(1):16-18.

        [3]Zhu T,Zhang W,Wang DX.Insulin up-regulates epithelial sodium channel in LPS-induced acute lung injury model in rats by SGK1activation[J].Injury,2012,43(8):1277-1283.

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        [6]Zhu T,Zhang W,Wang DX,et al.Rosuvastatin attenuates mucus secretion in a murine model of chronic asthma by inhibiting the gamma-aminobutyric acid type A receptor[J].Chin Med J(Engl),2012,125(8):1457-1464.

        [7]Zhang L,Liu J,Liu Y,et al.Fluvastatin inhibits the expression of fibronectin in human peritoneal mesothelial cells induced by high-glucose peritoneal dialysis solution via SGK1pathway[J].Clin Exp Nephrol,2014,20:9124-9130.

        [8]張維,朱濤,王導(dǎo)新,等.瑞舒伐他汀抑制小鼠哮喘模型慢性氣道炎癥反應(yīng)的實驗研究[J].西部醫(yī)學(xué),2014,26(02):150-153.

        [9]王導(dǎo)新,鄧旺.急性呼吸窘迫綜合征肺水腫液清除與正壓通氣研究進展[J].西部醫(yī)學(xué),2014,26(2):133-135.

        [10]Duivenvoorden R,Tang J,Cormode DP,et al.A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atheroscle-rotic plaque inflammation[J].Nat Commun,2014,5:3065.

        [11]劉佩英,徐道妙.辛伐他汀對脂多糖誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細胞鈉通道α亞基的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2012,24(10):604-607.

        [12]Mattes C,Laube M,Thome UH.Rapid elevation of sodium transport through insulin is mediated by AKT in alveolar cells[J].Physiol Rep,2014,2(3):00269.

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