張萬紅(綜述)，焦慧英(審校)

(天津市泰達(dá)醫(yī)院眼科，天津 300457)

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微RNA在眼部疾病中的研究進(jìn)展

張萬紅(綜述)，焦慧英※(審校)

(天津市泰達(dá)醫(yī)院眼科，天津 300457)

摘要：微RNA(microRNA)為生物體內(nèi)內(nèi)源性小分子RNA，由約22個單核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子構(gòu)成。microRNA參加生物體內(nèi)多種生物學(xué)功能，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、能量代謝、生長發(fā)育、繁殖及相關(guān)病例生理過程。microRNA是生物(包括人)體內(nèi)重要的生物調(diào)節(jié)小分子，在體內(nèi)行使多種生物學(xué)功能。近年來研究顯示，microRNA在眼科疾病中同樣發(fā)揮重要作用。因此，隨著microRNA及眼科相關(guān)疾病的研究逐步深入，micorRNA有望成為眼科相關(guān)疾病的診斷與治療開辟新的領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：眼部疾病；微RNA；作用機制

微RNA(microRNA)是生物體內(nèi)一類特殊的RNA分子，它由長度為22個核苷酸左右的非編碼單鏈RNA 分子構(gòu)成，microRNA在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。大多數(shù)microRNA 以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在于細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA參與人類各種生命活動的調(diào)節(jié)，例如發(fā)育、病毒防御、器官形成等[1]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，RNA小干擾技術(shù)在眼科領(lǐng)域中有較大的潛在作用[2]，現(xiàn)就RNA小干擾技術(shù)近年來在眼科疾病中的應(yīng)用及未來應(yīng)用方向進(jìn)行綜述。

1microRNA的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)90年代，Lee等[3]首先對一種簡單的多細(xì)胞生物——秀麗桿線蟲進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)該生物體內(nèi)存在一種內(nèi)源性小分子單鏈RNA(被命名為lin-4)。lin-4 由22個核苷酸組成，本身沒有開放的閱讀框，因而無法編碼蛋白質(zhì)。但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，lin-4參與秀麗桿線蟲的幼蟲到成蟲的發(fā)育過程，其作用機制可能與其抑制核蛋白體lin-14有關(guān)[4]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是因為lin-14編碼的小分子RNA 3′非編碼區(qū)擁有上游調(diào)控序列與lin-4存在單核苷酸互補序列，從而造成上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制發(fā)生改變，抑制了RNA聚合酶與lin-14的結(jié)合，進(jìn)而降低了其表達(dá)水平[4]。5年后相似功能的microRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，包括microRNA-let-7等[5-6]。此后，隨著高通量測序、生物信息學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，大量microRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。

2microRNA作用機制

自1990年有研究者[7]將產(chǎn)生色素的DNA置于強啟動子再導(dǎo)入牽?；ㄔ噲D加深花朵紫色，但結(jié)果未見到深紫色花朵反而變成了白色，因此該研究者首先將這種現(xiàn)象命名為協(xié)同抑制，這種現(xiàn)象的發(fā)生不僅存在于植物牽?；ㄖ?，同時在真菌中也得到了證實，但當(dāng)時各國學(xué)者并未關(guān)注。后續(xù)關(guān)于秀麗干線蟲的實驗表明，線蟲消化道中注入雙鏈DNA可以阻斷線蟲同源基因表達(dá)，還可導(dǎo)致同源基因沉默，后來稱這種現(xiàn)象為RNA干擾[8]，并逐漸被關(guān)注。RNA的干擾過程可以在多種生物細(xì)胞(如昆蟲、線蟲、植物甚至于人體)中存在，此現(xiàn)象說明RNA干擾并非偶然而是在生命長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生的防御系統(tǒng)。RNA干擾現(xiàn)象成為許多學(xué)者研究的熱點，RNA干擾作用機制并未明確，但經(jīng)過大量研究總結(jié)其認(rèn)同的機制有如下幾點。由外源導(dǎo)入或病毒感染等引入雙鏈RNA，并同雙鏈RNA特異性核酸內(nèi)切酶，即DICER酶-RNaseⅢ中的特異性核酸內(nèi)切酶[9](包含1個N端RNA解旋酶、1個PAZ結(jié)構(gòu)域、2個 RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)和1個末端雙鏈RNA)相互作用。Dicer一般作用于長度為200~500 bp 雙鏈RNA的末端，產(chǎn)生21~23 nt microRNA(小干擾RNA)，每個小干擾RNA末端均有核苷，Dicer酶通過PAZ結(jié)構(gòu)域同Argonaute相互作用。核酸內(nèi)切酶同Argonaute相連，再同小干擾RNA結(jié)合形成多個亞單元核苷酸復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC解旋酶使用ATP將小干擾RNA雙鏈解開，將同源信使RNA同小干擾RNA反義鏈互補。RISC將信使RNA降解并使其在細(xì)胞和機體內(nèi)表達(dá)水平下降，從而降低或喪失其功能。此外，microRNA還可以進(jìn)行表觀遺傳學(xué)修飾，包括組蛋白修飾(甲基化，乙?；?，DNA甲基化以及基因印跡等，從而使下游相關(guān)基因功能加強或降低來調(diào)控細(xì)胞和機體的生物學(xué)行為。

3microRNA在眼科疾病中的應(yīng)用

由于內(nèi)源性microRNA存在眾多生物學(xué)功能，因而采用腺病毒或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑包裝的外源性microRNA轉(zhuǎn)染哺乳動物，可在動物體內(nèi)發(fā)揮類似內(nèi)源性microRNA的作用。該研究方法是目前microRNA研究的方向和重點[10]。同時眼是人體相對獨立的組織器官，在一定情況下不受機體免疫功能的監(jiān)控和影響，因而給microRNA的治療提供了較大空間。Mysara等[11]的研究中，將小干擾RNA于玻璃體中注射，很快可在眼組織中擴散，且維持時間久，對其他組織影響小。利用RNA干擾治療可有效沉默眼部基因，避免其他部位同種基因的“脫靶”效應(yīng)，這也為眼部“基因敲除”提供有效途徑。

3.1microRNA與眼科新生血管性疾病血管性疾病在眼科較為常見，也是導(dǎo)致患者視力發(fā)生改變的重要原因之一。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與多種眼科血管增生性疾病有關(guān)，同時進(jìn)一步的研究顯示，通過單克隆抗體抑制VEGF的表達(dá)或其內(nèi)源性活性可以提高患者的視力水平[12]。動物研究顯示，將外源性表達(dá)VEGF/小干擾RNA采用腺病毒包裝后在大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞進(jìn)行注射，通過免疫檢測發(fā)現(xiàn)靶向小干擾RNA可有效減少VEGF在脈絡(luò)膜的表達(dá)[13]。隨后他們在觀察脈絡(luò)膜的破裂并誘導(dǎo)新生血管生成的實驗中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用VEGF小干擾RNA治療眼新生血管面積顯著高于熒光蛋白組，說明靶向小干擾RNA抑制VEGF可減少脈絡(luò)膜血管新生。Takeuchi等[14]進(jìn)行了相應(yīng)的實驗檢測VEGF小干擾RNA在動物體內(nèi)的安全性，通過檢查視網(wǎng)膜熒光造影，觀測激光光凝后的破裂脈絡(luò)膜發(fā)現(xiàn)，VEGF小干擾RNA對視網(wǎng)膜電圖并無影響。一次玻璃體內(nèi)注射可抑制脈絡(luò)膜新生血管形成，持續(xù)效果30 d以上，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2microRNA與眼科纖維增生性疾病傷口過度修復(fù)會形成組織瘢痕纖維化，并發(fā)相關(guān)眼科疾病。研究表明，良好的濾過通道是青光眼手術(shù)的關(guān)鍵，纖維細(xì)胞過度增生使濾過泡瘢痕化是青光眼手術(shù)失敗的重要原因，所以抑制瘢痕增生是研究重點[6]。轉(zhuǎn)化生長因子β是轉(zhuǎn)化生長因子的一個亞型，于傷口愈合瘢痕形成中起重要作用。Chang和Wu[15]采用靶向轉(zhuǎn)化生長因子β2型受體的小干擾RNA培養(yǎng)的人角膜成纖維細(xì)胞，可有效抑制轉(zhuǎn)化生長因子β表達(dá)和結(jié)膜下炎性細(xì)胞的沉積。

3.3microRNA與細(xì)胞凋亡性眼病神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變形凋亡是青光眼和視神經(jīng)損傷后喪失視力的主要原因。Wallace和Cotter[16]將凋亡激酶活化因子1的靶向小干擾RNA注射到視神經(jīng)殘端觀測神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活，結(jié)果凋亡激酶活化因子1靶向小干擾RNA促進(jìn)了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活，但Bax靶向小干擾RNA并未對橫斷的視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生影響。故可以利用凋亡激酶活化因子1基因在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程的促進(jìn)作用進(jìn)行RNA干擾降低細(xì)胞凋亡。

3.4microRNA與氧化損傷性眼病氧化損傷是造成多種眼病的重要原因，如白內(nèi)障、視網(wǎng)膜色素變性等。Yeh等[17]通過培養(yǎng)p66Shc靶向小干擾RNA，可抵抗因為H2O2引起的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞氧化損傷，他們通過觀察視網(wǎng)膜電圖證實了這種小干擾RNA對于視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用。Nakatsugawa等[18]用RNA干擾晶狀體上皮中蛋氨酸亞砜還原酶基因A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞容易受到氧化損傷，但過度表達(dá)蛋氨酸亞砜還原酶基因可減少氧化損傷，說明RNA干擾可作為分析基因功能的有效途徑。

3.5microRNA與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是嬰幼兒時期的常見惡性腫瘤。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的病理發(fā)展過程中，VEGF為腫瘤的新生起重要作用。可以通過RNA干擾造成基因沉默抑制新生血管的生長，從而控制腫瘤。Jia等[19]在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤株中觀察到了小干擾RNA對VEGF具有抑制效果，再將腫瘤細(xì)胞株接種到大鼠皮下，于瘤體內(nèi)注射抗VEGF的小干擾RNA發(fā)現(xiàn)該類瘤體內(nèi)局部應(yīng)用小干擾RNA可顯著抑制VEGF表達(dá)，在治療1周后，VEGF小干擾RNA的瘤體體積減少了67%，這可能成為今后基因治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的新方向。

3.6microRNA與促進(jìn)視神經(jīng)再生視神經(jīng)是中樞神經(jīng)，軸突損傷后神經(jīng)節(jié)的存活或再生是近年研究重點。研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)所處微環(huán)境中存在3種抑制因子，但它們均通過共同受體——抑制分子受體發(fā)揮抑制作用[20-22]。對成年大鼠髓鞘蛋白進(jìn)行主動免疫后，被夾傷的視神經(jīng)可顯著再生，但構(gòu)成髓鞘蛋白的有效成分難以確定[23]。但可以確定的是，目前針對抑制分子受體的單克隆抗體可中和髓鞘中的抑制蛋白作用，加速體外神經(jīng)元再生，但難以在體內(nèi)作用。既往的一項研究中，通過對腺病毒攜帶的抑制分子受體小干擾RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染后可抑制抑制分子受體表達(dá)，并促進(jìn)受損視神經(jīng)軸突再生[24]。

4結(jié)語

目前RNA干擾現(xiàn)象在人類多種慢性疾病及惡心腫瘤中發(fā)揮重要作用，microRNA在人類疾病的病因、診斷及治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。而眼部組織結(jié)構(gòu)特殊，一直是作為基因治療的理想器官。雖然目前RNA干擾技術(shù)于眼科疾病的治療方面尚處于實驗階段，但隨著RNA干擾技術(shù)的完善與發(fā)展，以及該技術(shù)在其他領(lǐng)域中的成功應(yīng)用預(yù)示RNA干擾同樣會在眼科治療中得到更多應(yīng)用[25]，并為眼科學(xué)的發(fā)展提供有力的分子生物學(xué)工具。

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致作者：

1.文章中使用縮略語、略稱、代號時，在首次出現(xiàn)時必須加注中文并寫出英文全稱，如：肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)。

2.參考文獻(xiàn)的書寫要規(guī)范(包括標(biāo)點符號)，格式如下：

①期刊： 作者.文題[J].刊名，年，卷(期)：起-止頁碼.

②專著： 著者.書名[M].版次.出版地：出版者，出版年：起-止頁碼.

Research Progress on MicroRNA in Eye DiseasesZHANGWan-hong，JIAOHui-ying.(DepartmentofOphthalmology,TianjinTEDAHospital,Tianjin300457,China)

Abstract:MicroRNA(miRNA) is a kind of endogenous small RNAs in organisms,consisting of about 22 nucleotides around noncoding single-stranded RNA molecules.It has been revealed that miRNA involves in a variety of biological functions,including transcriptional regulation,energy metabolism,growth,reproduction and related cases of physiological processes.MiRNA is an important small molecule in biological organisms(including human),acting on a variety of biological functions.Recent studies have shown it also plays an important role in eye diseases.Therefore,as the study on miRNA and eye disease develops,miRNA may bring new direction for the diagnosis and treatment of eye diseases.

Key words:Eye diseases; MicroRNA; Mechanism

收稿日期：2014-06-19修回日期：2014-11-17編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.020

中圖分類號:R771.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)13-2356-03