李紅梅，王顯

· 論著 ·

水蛭素對體外培養(yǎng)的人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響

李紅梅，王顯

目的探討水蛭素對體外培養(yǎng)的人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）和人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）生長的影響及劑量依賴關(guān)系，明確水蛭素抗再狹窄的有效性和可行性。方法用體外培養(yǎng)的HCASMC和HCAEC 3～5代，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置調(diào)零孔、對照孔、加藥孔（6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/ml不同濃度水蛭素共9組，每組6個復(fù)孔），培養(yǎng)48 h后用噻唑藍(lán)比色試驗(yàn)（MTT法）檢測不同濃度水蛭素干預(yù)下兩種細(xì)胞的活力和抑制率變化。結(jié)果與對照組相比，低濃度（0.025～0.1 mg/ml）水蛭素在對HCASMC增殖的影響方面無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05），而中高濃度（0.2～6.25 mg/ml）的水蛭素抑制HCASMC增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），且其抑制率隨水蛭素濃度升高而增加。與對照組相比，0.025～3.13 mg/ml的水蛭素在對HCAEC增殖的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），但0.05～0.2 mg/ml的水蛭素對HCAEC有一定的促增殖作用；而高濃度（6.25 mg/ml）的水蛭素對HCAEC增殖的抑制增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），其抑制率達(dá)到44.6%。結(jié)論中高濃度水蛭素可呈劑量依賴性抑制HCASMC的生長，低中濃度水蛭素對HCAEC無明顯抑制作用，且能在抗血栓的同時保護(hù)HCAEC甚至促進(jìn)HCAEC生長。

水蛭素；人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞；人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞；抑制率

動脈粥樣硬化性心血管疾病引發(fā)的急性心血管事件嚴(yán)重危害人類生命健康，經(jīng)導(dǎo)管支架植入術(shù)成為目前治療的有效途徑，其中藥物洗脫支架的出現(xiàn)更是推動了介入的發(fā)展。隨著研究逐步深入，發(fā)現(xiàn)藥物洗脫支架抑制平滑肌細(xì)胞增殖遷移，同時也延緩內(nèi)皮化進(jìn)程，支架術(shù)后遺留的10%～20%再狹窄以及延遲性支架血栓形成風(fēng)險成為介入領(lǐng)域廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年，水蛭素作為凝血酶的特異性抑制劑，在減輕實(shí)驗(yàn)性再狹窄和抗血栓方面有很好的應(yīng)用前景。本研究利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察不同濃度水蛭素對體外培養(yǎng)的人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）和人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）生長和增殖的影響，以期為藥物涂層支架的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑HCASMC（貨號：FC-0031）、HCAEC（貨號：FC-0032）、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、胰酶抑制劑、凍存液均購自美國Lifeline公司；磷酸鹽緩沖液、噻唑蘭（MTT）粉末250 mg、二甲基亞礬（DMSO）瓶裝100 ml均購自北京索萊寶科技有限公司；科研級天然水蛭素凍干粉（武漢勝天宇生物科技有限公司）。

1.2 儀器超凈工作臺CJT-E-Ⅱ（北京昌平長城空氣凈化工程公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus CKX×41）、低速離心機(jī)LD4-2（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）、培養(yǎng)箱MCO-20AIC（SANYO Elecronic.Ltd.JAPEN）、-80℃低溫冰箱（美國REVCO Legaci）、電熱恒溫水箱（HH. W21.420）、全自動酶標(biāo)儀（Clinicbio 128C）、電子分析天平（日本島津AEC-45SM）。

1.3 方法

1.3.1 HCASMC和HCAEC將保存于液氮中的細(xì)胞取出，立刻放到干冰上，將細(xì)胞浸入37℃水浴中，待細(xì)胞懸液融化后接種于培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基。之后2～3 d傳代一次，實(shí)驗(yàn)選用4～6代細(xì)胞。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置調(diào)零組、對照組（5個復(fù)孔）、干預(yù)組（6個復(fù)孔）。調(diào)零組不加細(xì)胞，對照組僅加細(xì)胞，干預(yù)組給予不同濃度藥物（6.25 mg/ml組、3.13 mg/ml組、1.56 mg/ml組、0.78 mg/ml組、0.39 mg/ml組、0.2 mg/ml組、0.1 mg/ml組、0.05 mg/ml組、0.025 mg/ml組）。

1.3.3 細(xì)胞接種當(dāng)細(xì)胞占整個瓶底70%～80%時，將細(xì)胞消化計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為8×104個/ mL，接種于96孔板（調(diào)零組加100μl無細(xì)胞培養(yǎng)基），100μl/孔，邊緣孔加入150μl PBS液，然后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日加藥。

1.3.4 加藥次日取出96孔板以無菌PBS沖洗2遍，調(diào)零組和對照組每孔加入100μl正常培養(yǎng)基，干預(yù)組每孔加入含相應(yīng)濃度水蛭素的培養(yǎng)基，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中，孵育48 h。

1.3.5 細(xì)胞抑制率檢測48 h后向各孔培養(yǎng)基內(nèi)加入20μl 0.5 mg/ml的對應(yīng)MTT培養(yǎng)基溶液，然后置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，每孔加150μl DMSO振蕩10 min，待結(jié)晶全部溶解后于酶標(biāo)儀492 nm處測各孔A值，并計算不同濃度水蛭素對平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制率。細(xì)胞抑制率=1-（干預(yù)組OD值/對照組OD值）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)的比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)通過倒置相差顯微鏡觀察，剛復(fù)蘇的HCASMC和HCAEC均漂浮于培養(yǎng)基中呈未貼壁狀態(tài)，細(xì)胞縮為圓形，單個或成團(tuán)存在，體積較??；培養(yǎng)6 h后大部分細(xì)胞貼壁，24 h后細(xì)胞貼壁完全。貼壁的HCAEC由圓形變?yōu)闄E圓或多角形，折光性較強(qiáng)，胞質(zhì)豐富，呈“鋪路石”樣排列，4 d后進(jìn)入對數(shù)生長期；HCASMC貼壁后逐漸變?yōu)樗笮?，伸展性好，透明度增加? d后進(jìn)入對數(shù)生長期并相互重疊生長，呈致密束狀排列。

2.2 不同濃度水蛭素對HCASMC生長及增殖的影響倒置顯微鏡鏡下觀察，低濃度水蛭素（0.025～0.2 mg/ml）作用48 h后細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量未見明顯改變，中高濃度水蛭素（0.39～6.25 mg/ ml）作用24 h即可見細(xì)胞形態(tài)略有改變，48 h后細(xì)胞數(shù)量減少、排列疏松。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示：與對照組相比，低濃度（0.025～0.1 mg/ml）水蛭素在對HCASMC增殖的影響方面無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05），細(xì)胞抑制率均低于11%，而中高濃度（0.2～6.25 mg/ml）的水蛭素抑制HCASMC增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），且其抑制率隨水蛭素濃度升高而增加，最高可至77.85%（表1、圖1）。

表1 不同濃度水蛭素抑制HCASMC增殖的比較

圖1 不同濃度水蛭素對人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響（*代表與對照組相比，水蛭素對HCASMC有明顯抑制作用；#代表與對照組相比，水蛭素對HCAEC有明顯抑制作用）

2.3 不同濃度的水蛭素對HCAEC生長及增殖的影響 倒置顯微鏡鏡下觀察，低濃度及中高濃度水蛭素（0.025～3.13 mg/ml）作用48 h后細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量未見明顯改變，呈單層貼壁狀態(tài)，高濃度水蛭素6.25 mg/ml作用48 h后可見細(xì)胞數(shù)量減少，貼壁的細(xì)胞有部分脫落。

結(jié)果顯示：與對照組相比，0.025～3.13 mg/ml的水蛭素在對HCAEC增殖的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但0.05～0.2 mg/ml的水蛭素對HCAEC有一定促增殖作用；而高濃度（6.25 mg/ml）的水蛭素則對HCAEC增殖產(chǎn)生較明顯的抑制作用，抑制率達(dá)44.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2、圖1）。根據(jù)原則需要挑選對HCASMC抑制程度最大，而對HCAEC抑制程度最小的濃度范圍，最終選擇0.2～3.13 mg/ml濃度組的水蛭素作為下一步實(shí)驗(yàn)水蛭素的濃度區(qū)間。

3 討論

表2 不同濃度水蛭素抑制HCAEC增殖的比較

目前認(rèn)為，介入術(shù)后再狹窄的機(jī)制可能與以下因素有關(guān)：球囊擴(kuò)張對血管壁的損傷，血管彈性回縮及血管收縮，血小板聚集黏附及血栓形成，炎癥反應(yīng)，血管平滑肌細(xì)胞增生遷移及動脈內(nèi)膜增生、血管重塑等[1]，其中血管平滑肌細(xì)胞的增殖遷移和內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮化延遲是再狹窄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年很多學(xué)者對介入術(shù)后再狹窄進(jìn)行了大量研究，通過實(shí)驗(yàn)及臨床結(jié)果證實(shí)很多天然單體防治再狹窄具有可靠的臨床療效，如水蛭素、三氧化二砷、大黃素、雷公藤紅素、丹參提取物等都有不少報道，在這些有效的天然提取物中，水蛭素除了能抑制平滑肌細(xì)胞增殖遷移外，以其獨(dú)特的抗血栓作用引起了我們的關(guān)注。

破血逐瘀的水蛭素是水蛭唾液的提取物之一，為凝血酶的特異性抑制劑，天然水蛭素第63位的酪氨酸被硫酸化，作用于凝血酶4個結(jié)合位點(diǎn)中的非活性底物識別位點(diǎn)和酶活性中心而發(fā)揮抗凝作用，該作用不依賴于抗凝血酶Ⅲ、肝素輔助因子Ⅱ、蛋白C或組織因子途徑抑制物，且不被血小板結(jié)合而失活，其抗凝和抗血栓作用比肝素更強(qiáng)。張濤等[2]發(fā)現(xiàn)水蛭素可通過抑制家兔介入術(shù)后平滑肌細(xì)胞增殖、減輕內(nèi)膜增生而發(fā)揮抗再狹窄作用。周小明等[3,4]研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素可呈劑量依賴性顯著抑制兔血管平滑肌細(xì)胞增殖和氚脫氧胸腺嘧啶（3H-TDR）的攝取，同時給動脈損傷大鼠予水蛭素粗提取物灌胃后14 d取頸總動脈進(jìn)行病理學(xué)觀察，可見水蛭素對損傷側(cè)血管內(nèi)膜增生有明顯的抑制作用。從以上研究結(jié)果可以看出，中藥水蛭素在防治介入術(shù)后再狹窄方面有著很好的研究前景，其對平滑肌細(xì)胞的抗增殖作用基本明確，然而目前針對單藥水蛭素對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長增殖影響的報道尚為數(shù)不多。因此，本研究用噻唑藍(lán)（MTT）法以不同濃度水蛭素干預(yù)HCASMC和HCAEC，以初步探究水蛭素的抗再狹窄機(jī)制并摸索出水蛭素的有效濃度范圍。

MTT法[5]是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。因本方法具有靈敏度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)，故本研究選擇MTT法作為檢測細(xì)胞生長增殖情況的基本方法。

研究發(fā)現(xiàn)[6]，3.13～25 μg/mL的水蛭素能在最大限度抑制兔平滑肌細(xì)胞的同時，尚能最大化保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，利用前期研究的濃度范圍作了一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，人冠狀動脈細(xì)胞對藥物的耐受性強(qiáng)于兔血管細(xì)胞，此濃度范圍對人血管細(xì)胞未產(chǎn)生影響。經(jīng)過摸索后選出人冠狀動脈細(xì)胞反應(yīng)良好的0.025～6.25 mg/ml作為正式實(shí)驗(yàn)濃度范圍進(jìn)行篩選。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度（0.025～0.1 mg/ ml）水蛭素對HCASMC生長和增殖沒有影響，而中高濃度（0.2～6.25 mg/ml）的水蛭素則對HCASMC的增殖有明顯抑制作用，且其抑制率與水蛭素濃度呈正相關(guān)。在對內(nèi)皮細(xì)胞影響方面，低中濃度（0.025～3.13 mg/ml）水蛭素對HCAEC生長的抑制作用不明顯，其中0.05～0.2 mg/ml的水蛭素對HCAEC有一定促增殖作用，而高濃度（6.25 mg/ml）的水蛭素即可顯著抑制HCAEC的生長和增殖，其抑制率接近50%。

綜上所述，水蛭素不僅有很好的抑制平滑肌細(xì)胞作用，還能在抗血栓的同時保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞甚至促進(jìn)其生長?；诖?，能否將水蛭素與另外一種具有很好抗平滑肌增殖但保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞力量不足的單體聯(lián)合應(yīng)用，放大水蛭素優(yōu)勢的同時達(dá)到聯(lián)合增效的目的呢？本團(tuán)隊(duì)將在后續(xù)的研究中對該假設(shè)加以證實(shí)，拓寬水蛭素的應(yīng)用空間。

[1] 黃潔,張梅英,劉利兵. PTCA后冠狀動脈再狹窄的研究進(jìn)展[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2001,22(2):104-5.

[2] 張濤,杜蘭萍,崔平,等. 水蛭和丹參對血管成形術(shù)后平滑肌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1998,18(3):159-61.

[3] 周小明,陸再英. 水蛭素對培養(yǎng)的兔動脈平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用[J]. 中國循環(huán)雜志,1996,11(2):103-5.

[4] 周小明,陸再英,汪道文,等. 水蛭素粗提物對實(shí)驗(yàn)性動脈內(nèi)膜增生的抑制作用[J]. 中藥藥理與臨床,1996,2(2):17-9.

[5] 司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正. 細(xì)胞培養(yǎng)[M]. 世界圖書出版公司,1996:186-8.

[6] 任曉霞. 紫杉醇水蛭素復(fù)合物對兔血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長的影響[D]. 山西:山西醫(yī)科大學(xué),2011.

Influence of hirudin on growth of in vitro human coronary artery smooth muscle cells and human coronary artery endothelial cells

LI Hong-Mei*, WANG Xian.*Institute for Cardiovascular Disease, First Clinical Medicine College, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China.

WANG Xian, E-mail: wx650515@163.com

ObjectiveTo investigate the influence of hirudin on growth of in vitro human coronary artery smooth muscle cells (HCASMC) and human coronary artery endothelial cells (HCAEC) and dose-dependent relation, and indentify the effectiveness and feasibility.MethodsHCASMC and HCAEC cultured in vitro (3-5 generations) were respectively seeded onto 96-well plates, and then co-incubated with different doses of hirudin (6.25 mg/ml, 3.13 mg/ml, 1.56 mg/ml, 0.78 mg/ml, 0.39 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml, and 0.025 mg/ml). After 48 h, the changes of viability and inhibitory rate of HCASMC and HCAEC were detected by using MTT.ResultsCompared with control group, the influence of low-dose hirudin (0.025 mg/ml～0.1 mg/ml) on HCASMC proliferation had no statistical difference (all P＞0.05), and that of mid-dose and high-dose of hirudin (0.2 mg/ml～6.25 mg/ml) inhibited HCASMC proliferation (all P＜0.05) and the inhibitory rate increased as the increase of hirudin dose. Compared with control group, the influence of hirudin in dose of 0.025 mg/ml～3.13 mg/ml on HCAEC proliferation had no statistical difference (all P＞0.05), but hirudin in dose of 0.05 mg/ml～0.2 mg/ml had improvement effect on HCAEC proliferation. The inhibition of hirudin in high dose (6.25 mg/ml) on HCAEC proliferation increased (all P＜0.05) and inhibitory rate reached 44.6%.ConclusionHirudin in mid-dose and high-dose can inhibit HCASMC growth in and dosedependent manner, while hirudin in low-dose had no significant inhibitory effect on HCAEC growth, and can protect even improve HCAEC growth at the same time of anti-thrombosis

Hirudin; Human coronary artery smooth muscle cells; Human coronary artery endothelial cells; Inhibitory rate

R543.3

A

1674-4055(2015)06-0792-03

2015-08-07）

（責(zé)任編輯：姚雪莉）

100700 北京,北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院博士研究生;北京中醫(yī)藥大學(xué)心血管病研究所

王顯,E-mail:wx650515@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2015.06.21