買超平，閻春生，哈小琴

· 論著 ·

海拔高度對冠心病患者EPCs數(shù)量及功能的研究

買超平，閻春生，哈小琴

目的探討不同海拔因素下，蘭州市（海拔：1520 m）與咸陽市（海拔：386 m）冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┗颊咄庵苎獌绕ぷ婕毎‥PCs）數(shù)量變化。方法2014年4月至12月分別在蘭州軍區(qū)總醫(yī)院心內科/體檢中心和咸陽市中心醫(yī)院心內科/體檢中心共納入96例。各選取冠心病患者24例為冠心病組，男性12例，女性12例，平均年齡（60.6±10.9）歲；健康體檢者24例為對照組，男性12例，女性12例，平均年齡（58.3±8.9）歲。使用流式細胞儀測定入選者外周血EPCs數(shù)量。通過ELISA法測定其外周血血清中白介素8（IL-8）、血管內皮生長因子（VEGF）、高同型半胱氨酸（HCY）、低氧誘導因子1α（HIF-1α）、基質細胞衍生因子1a（SDF-1a）。熒光定量PCR檢測外周血單核細胞因子CXCR2 mRNA、CXCE4 mRNA、CXCR7 mRNA表達情況。結果蘭州市冠心病組EPCs數(shù)量與hs-CRP濃度之間進行Spearman相關分析，呈負相關（r=-0.631，P＜0.05）。與對照組比較，蘭州市冠心病組HCY降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在咸陽市，與對照組比較，冠心病組IL-8、HCY降低，VEGF升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與蘭州市冠心病組比較，咸陽市IL-8降低，VEGF升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。在女性入選者中，蘭州市冠心病組較對照組HCY降低；與對照組比較，咸陽市冠心病組IL-8升高，HIF-1α下降，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與蘭州市冠心病組比較，咸陽市IL-8升高，HIF-1α降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與蘭州市比較，咸陽市入選者CXCR2表達上調，為（0.91± 0.13） vs. （4.8±1.87），有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結論冠心病患者較健康人EPCs數(shù)量有所降低，低海拔地區(qū)健康人較高海拔地區(qū)數(shù)量增加。IL-8、VEGF、HCY、HIF-1a、SDF-1a、CXCR2因子對研究不同海拔及性別因素下EPCs功能情況有意義，前景廣闊。

海拔；冠心??；內皮祖細胞

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑牟±頇C制十分復雜，與家族遺傳、環(huán)境等因素有關。內皮細胞的損傷能夠加重動脈粥樣硬化并且與冠心病的發(fā)生發(fā)展關系密切。血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）為內皮細胞的前體細胞，在組織缺血及血管損傷時動員入血，參與微血管的生成及血管內皮的修復。Schmidt-Lucke等[1]研究發(fā)現(xiàn)，EPCs數(shù)量的減少是動脈粥樣硬化患者疾病發(fā)展的預測因子之一；Eizawa等[2]比較分析了循環(huán)EPCs的數(shù)量，穩(wěn)定型心絞痛患者EPCs數(shù)目降低而不穩(wěn)定型心絞痛患者循環(huán)EPCs卻升高。大多數(shù)研究數(shù)據(jù)表明，EPCs數(shù)量越多，心血管疾病風險及死亡率就越低[3-5]。許多生長因子、細胞因子、趨化因子及內皮細胞的凋亡體都可影響EPCs的動員、歸巢、增殖、分化、遷移和凋亡[6]。而不同海拔高度情況下冠心病患者內皮祖細胞數(shù)量和功能的變化情況，國內外研究較少。本研究檢測了不同海拔高度下冠心病患者EPCs數(shù)量及功能情況。

1 資料與方法

1.1 研究和對象2014年4月至12月分別在蘭州軍區(qū)總醫(yī)院心內科/體檢中心和咸陽市中心醫(yī)院心內科/體檢中心共納入96例。各選取冠心病患者24例為冠心病組，男性12例，女性12例，平均年齡（60.6±10.9）歲；健康體檢者24例為對照組，男性12例，女性12例，平均年齡（58.3±8.9）歲。納入標準：均為長住居民（＞10年）；冠心病患者行冠狀動脈造影或心臟CTA檢查明確診斷為冠心病，標準參考2009年經皮冠狀動脈介入治療指南[7]，每個冠狀動脈病變至少采集2個相互垂直的投視角圖像，直徑狹窄≥50%病變則認為有臨床意義。排除合并瓣膜性心臟病、心肌病、糖尿病、急慢性感染、外傷、潰瘍、視網膜病、腫瘤、近期外科手術、近3個月發(fā)生急性心肌梗死、急性心功能不全等。

1.2 方法

1.2.1 EPCs數(shù)量的測定采用流式細胞術檢測外周血CD45、CD34+、KDR+、EPCs的比例。經前臂靜脈抽取外周靜脈血5 ml肝素抗凝，取200μl加入EP管中，再分別加入5μl FITC標記的CD45抗體，PE標記的KDR抗體，APC標記的CD34抗體。每個樣本設立陰性對照，只加CD45抗體?；靹蚝笫覝乇芄夥跤?0 min后每管中再加入6 ml紅細胞裂解液避光反應15 min，充分溶解紅細胞離心后棄上清液再加入500 μl磷酸緩沖液，最后上流式細胞儀測定。

1.2.2 生化指標檢測空腹抽取外周靜脈血，肝素抗凝，檢測總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇。利用OLYMPUS-5421全自動生化分析儀，采用免疫散色比濁法測定血清中C反應蛋白（CRP）含量。

1.2.3 細胞因子和同型半胱氨酸檢測入選病例均抽取空腹靜脈血5 mL，3000 rpm離心5 min后吸取血清，置于-70℃保存。成批檢測，使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法），試劑盒購自Sigma公司，檢測各樣本血清中白介素8（IL-8）、血管內皮生長因子（VEGF）、缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、基質細胞衍生因子1a（SDF-1a）、同型半胱氨酸（HCY），操作嚴格按照試劑盒說明書進行，酶標儀450 nm測得吸光度值，通過標準曲線，計算各樣本血清中細胞因子的濃度。

1.2.4 檢測單核細胞趨化因子受體2（CXCR2）、趨化因子受體4（CXCR4）、趨化因子受體7（CXCR7） mRNA相對表達量 在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中將CXCR2、CXCR4（NM-022205.3）、C X C R 7（N M-0 5 3 3 5 2.1）、G A P D H（M-017008.3）的核苷酸序列查找出來，根據(jù)引物設計原則，軟件Primer 5.0設計引物。序列如下：CXCR2上游引物：5’-TCGCCGTCGTGCTC ATCTTCC-3’，下游引物：5’-GGCGCTCACAC GTCTCCTGGA-3’。

CXCR4上游引物：5’-GGGTTGGTAAT CCTGGTC-3’， 下游引物：5’-ATGATG TGCTGGAACTGG-3’； CXCR7上游引物：5’-AACCTGGGAACTACTCGG -3’，下游引物：5’-CAAGACGCAGACAACACG-3’。樣本抗凝處理后立刻按照密度梯度離心法提取單核細胞，Trizol試劑提取細胞總RNA，氯仿抽提，異丙醇乙醇沉淀洗滌后，用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過的水溶解RNA測定RNA OD值，紫外分光光度計算出濃度[1000/OD值（260 nm～280 nm）]，根據(jù)TAKALA逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，-20℃保存，以cDNA為模板按照反應條件：95℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)。最后72 ℃ 10 min，降溫到4 ℃。進行實時熒光定量PCR擴增反應。實驗設置副孔，取平均CT值，根據(jù)公式：ΔΔCT＝（CT目的基因－CT內參）冠心病組－（CT目的基因－CT內參）健康組；算出倍數(shù)＝2－ΔΔCT。

1.3 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件。計數(shù)資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蘭州、咸陽市入選者外周血內皮祖細胞數(shù)量比較與對照組比較，蘭州市與咸陽市冠心病組EPCs數(shù)量略有增加，但對比無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。蘭州市對照組和冠心病組與咸陽市比較，差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）（表1）。

2.2 蘭州市冠心病組EPCs數(shù)量與hs-CRP水平相關性分析蘭州市冠心病組EPCs數(shù)量與高敏C反應蛋白（hs-CRP）濃度之間進行Spearman相關分析，呈負相關（r=-0.631，P＜0.05）。

2.3 男性入選者IL-8、VEGF、HCY、SDF-1a、HIF-1α檢測結果與對照組比較，蘭州市冠心病組HCY降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在咸陽市，與對照組比較，冠心病組IL-8、HCY降低，VEGF升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與蘭州市冠心病組比較，咸陽市IL-8降低，VEGF升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（表2）。

2.4 女性入選者IL-8、VEGF、HCY、SDF-1a、HIF-1α檢測結果在女性入選者中，蘭州市冠心病組較對照組HCY降低；與對照組比較，咸陽市冠心病組IL-8升高，HIF-1α下降，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與蘭州市冠心病組比較，咸陽市IL-8升高，HIF-1α降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（表3）。

2.4 單核細胞中CXCR2、CXCR4和CXCR7的mRNA表達檢測與蘭州市比較，咸陽市入選者CXCR2表達上調，為（0.91±0.13） vs. （4.8± 1.87），有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表4）。

3 討論

EPCs數(shù)量下降及功能減退與冠心病發(fā)病有關。有研究表明，EPC數(shù)量減少是動脈粥樣硬化的獨立危險因素。其在內皮修復過程中起著重要作用。Zhang Q等[8]認為EPCs的數(shù)量水平可預測心血管不良事件。CD34/KDR雙陽性是檢測內皮祖細胞數(shù)量的主要方法[9]。方葉青等[10]發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血EPCs數(shù)量較正常人明顯減少，而且形成細胞集落數(shù)、細胞的增殖能力也明顯降低。

CRP是一種急性期反應蛋白，可以反應炎癥水平，能激活補體、促進吞噬并具有其他的免疫調控作用[11]。陳良友等[12]研究表明，冠心病患者CRP和血漿HCY均高于對照組。IL-8具有趨化作用，可使大量T細胞和巨噬細胞出現(xiàn)在斑塊破裂的部位，對粥樣斑塊的形成和破裂有重要作用。唐任光等[13]發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清IL-8水平高于正常對照組。王進等[14]認為EPCs數(shù)量與VEGF濃度呈正相關。同時Strakova J 等[15]認為血漿HCY水平升高也是冠心病獨立危險因素。HIF-1 α是調節(jié)細胞內氧代謝的關鍵因子之一，由組織中分子氧水平的改變所誘導，能激活許多缺氧反應性基因的表達，使機體產生一系列低氧適應反應[16-18]。

EPCs介導的血管生成過程受許多生化因子的調控，一些研究認為CXCR7能夠促進EPCs的增殖、粘附、趨化和激活下游信號分子[19]。Hristov M等[20]發(fā)現(xiàn)CXCR2及其配體CXC趨化因子也參與了EPCs的動員、增殖、遷移，促進了EPCs的黏附功能。

表1 外周血內皮祖細胞（CD34、KDR雙陽性率）數(shù)量比較

表2 蘭州市及咸陽市男性冠心病組與對照組比較（ng/L）

表3 蘭州市及咸陽市女性冠心病組與對照組比較（ng/L）

冠心病的病理機制十分復雜，且與危險因素、家族遺傳、環(huán)境等方面均有關，而國內外學者對冠心病的具體機制尚未達成共識。本研究通過測量細胞因子的水平以及表達，分析可能的致病機制。同時，本研究還存在一些局限性，比如由于患者的配合程度和經費條件所限，兩地樣本的提取數(shù)量太少。另外，關于海拔因素下冠心病患者EPCs的功能變化文獻較少，選擇測定因子的實驗研究處于探索階段。

表4 單核細胞中CXCR2、CXCR4和CXCR7的mRNA表達

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Quantity and function of endothelial progenitor cells in patients with coronary heart disease influenced by different altitude factors

MAI Chao-ping*, YAN Chun-sheng, HA Xiao-qin.*College of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China.

YAN Chun-sheng, E-mail: yanchsh@lzu.edu.cn

ObjectiveTo discuss the quantity changes of endothelial progenitor cells (EPCs) in patients with coronary heart disease (CHD) influenced by different altitude factors (altitude=1520 m in Lanzhou City and altitude=386 m in Xianyang City).MethodsThe cases (n=96) were chosen from Lanzhou City and Xianyang City from Apr. 2014 to Dec. 2014, and then 24 CHD patients (male 12, female 12 and average age=60.6±10.9) were chosen respectively from Lanzhou City and Xianyang City as Lanzhou CHD group and Xianyang CHD group, and 24 healthy controls (male 12, female 12 and average age=58.3±8.9) were chosen respectively from Lanzhou City and Xianyang City as Lanzhou control group and Xianyang control group. The quantity of EPCs of peripheral blood (PB) was detected by using flow cytometer. The changes of PB serum interleukin-8 (IL-8), vascular endothelial growth factor (VEGF), homocysteine (Hcy), hypoxia inducible factor-1a (HIF-1α) and stromal cell derived factor 1a (SDF-1a) were detected by using ELISA. The expressions of PB mononuclear monocytes-CXCR2 mRNA, CXCE4 mRNA, CXCR7 mRNA were detected by using RT-PCR.ResultsIn Lanzhou CHD group, Spearman correlation analysis showed that EPCs quantity was negatively related to hs-CRP concentration (r=-0.631, P＜0.05). Compared with Lanzhou control group, Hcy decreased in Lanzhou CHD group (P＜0.05). Compared with Xianyang control group, IL-8 and Hcy decreased and VEGF increased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). Compared with Lanzhou CHD group, IL-8 decreased and VEGF increased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). Among woman objects, Hcy decreased in Lanzhou CHD group compared with Lanzhou control group. Compared with Xianyang control group, IL-8 increased and HIF-1α decreased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). Compared with Lanzhou CHD group, IL-8 increased and HIF-1α decreased in Xianyang CHD group (all P＜0.05). The expression of CXCR2 was up-regulated in Lanzhou group compared with Xianyang group [(0.91±0.13) vs. (4.8±1.87), P＜0.05].

R541.4

A

1674-4055(2015)06-0754-04

2015-06-26）

（責任編輯：姚雪莉）

國家自然科學基金資助課題(81060015);甘肅省自然基金項目(110TRJ2A114)

730000 蘭州,蘭州大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所(買超平,閻春生);蘭州軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科(哈小琴)

閻春生,E-mail:yanchsh@lzu.edu.cn;哈小琴,E-mail:18294437996@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2015.06.09