張 偉，余珊珊，陳愛明

(1.江蘇省蘇州市第一人民醫(yī)院,江蘇 蘇州 215006；2.江蘇省南通市通州區(qū)人民醫(yī)院,江蘇 南通 226300)

頭花蓼治療變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠的療效及作用機(jī)制探討

張 偉1，余珊珊2，陳愛明1

(1.江蘇省蘇州市第一人民醫(yī)院,江蘇 蘇州 215006；2.江蘇省南通市通州區(qū)人民醫(yī)院,江蘇 南通 226300)

目的探討頭花蓼治療變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)小鼠的療效及機(jī)制。方法將36只Balb/C小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、頭花蓼低濃度組、頭花蓼中濃度組、頭花蓼高濃度組及地塞米松組6組，每組6只。除正常組外，其余組均采用異硫氰酸熒光素(FITC)誘導(dǎo)小鼠ACD模型。造模成功第2天后，頭花蓼低、中、高濃度組分別灌胃2.5%，5%，10%頭花蓼溶液0.4mL，地塞米松組灌胃0.4mL地塞米松溶液，均連續(xù)7d。觀察各組小鼠皮損形態(tài)、組織病理改變以及血清白細(xì)胞介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平變化。結(jié)果治療7d后，頭花蓼低、中、高濃度組和地塞米松組小鼠的皮損形態(tài)和組織病理結(jié)構(gòu)較治療前明顯改善；與模型組比較，頭花蓼低、中、高濃度組和地塞米松組右耳厚度、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)、血清IL-4和TNF-α水平均顯著降低(P均<0.05)，但血清IFN-γ水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)意義(P均>0.05)。結(jié)論頭花蓼對ACD小鼠有顯著治療作用，可能與降低IL-4和TNF-α水平有關(guān)。

頭花蓼；變應(yīng)性接觸性皮炎；小鼠

變應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)又稱接觸性過敏，是皮膚、黏膜接觸致敏物后，由T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅳ型遲發(fā)型超敏反應(yīng)而引起的炎癥性皮膚病[1]。ACD的發(fā)病過程為：半抗原接觸皮膚后與體內(nèi)蛋白結(jié)合形成完全抗原，完全抗原被朗格漢斯細(xì)胞攝取后提呈給初始T細(xì)胞，并使其活化產(chǎn)生特異性T細(xì)胞；當(dāng)機(jī)體再次接觸相應(yīng)抗原時(shí)就會發(fā)生強(qiáng)烈的超敏反應(yīng)，從而引起接觸性皮炎。研究證明ACD的發(fā)病受多種炎癥細(xì)胞因子和化學(xué)遞質(zhì)的調(diào)控[2]。頭花蓼(Polygonum capitatum)是蓼科蓼屬多年生草本植物的全草，其主要成分為黃酮類化合物和沒食子酸類化合物[3-4]，為貴州苗族用藥。頭花蓼具有清熱利濕、和血散瘀和解毒止痛的功效，既往動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究已經(jīng)證實(shí)其對于膀胱炎、前列腺炎等泌尿系統(tǒng)感染具有較好的療效[5-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，頭花蓼對皮炎可能也有一定的作用[8]。為進(jìn)一步證明頭花蓼的抗皮炎活性，同時(shí)尋找ACD的有效治療藥物，本研究擬通過建立小鼠ACD模型，觀察頭花蓼對ACD模型小鼠的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 Balb/c雌性小鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量18～24g，動物合格證號：2007000555679，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供。SPF級實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7d后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品與試劑 丙酮(中國上海試劑總廠)；酸氫二鈉(長沙唐華化工貿(mào)易有限公司)；頭花蓼藥物粉末(頭花蓼浸膏粉，貴州威門制藥股份有限公司提供)；地塞米松溶液(仙居制藥有限公司，批號:1405086021)；0.9%氯化鈉注射液(中國大冢制藥有限公司，批號:H12020025)；白細(xì)胞介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(北京嘉美紐諾生物科技有限公司)；微測量卡尺(日本Mitutoyo公司)。異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)致敏劑配制：250mg FITC中加入1∶1體積比的丙酮與分析純混合液50mL，配成0.5%的FITC溶液。頭花蓼灌胃液配制：取頭花蓼粉末溶解于蒸餾水中，配成2.5%，5%，10%的頭花蓼溶液。地塞米松灌胃液配制：取地塞米松3mg，溶解于蒸餾水中配制成20mL地塞米松溶液。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組和ACD模型的建立 36只Balb/c小鼠隨機(jī)分成正常對照組、模型組、頭花蓼低濃度組、頭花蓼中濃度組、頭花蓼高濃度組、地塞米松組, 每組6只。正常對照組未做任何處理。其他組小鼠于實(shí)驗(yàn)前1d腹部備皮，面積約2cm×2cm，第1天和第2天分別于備皮部位涂布0.04mL 0.5%FITC溶液致敏1次，建立腹部ACD模型；同時(shí)，第1天和第2天也分別于小鼠右耳背涂布0.04mL 0.5% FITC溶液致敏1次，建立耳部ACD模型；通過皮損部位形態(tài)學(xué)特征和皮損病理表現(xiàn)判斷ACD模型是否成功建立。

1.3.2給藥方法正常對照組、模型組每日給予0.4mL蒸餾水灌胃；頭花蓼低濃度組、頭花蓼中濃度組、頭花蓼高濃度組、地塞米松組于造模成功第2天后，分別給予0.4mL 2.5%頭花蓼溶液、0.4mL 5%頭花蓼溶液、0.4mL 10%頭花蓼溶液和0.4mL地塞米松溶液灌胃，均連續(xù)7d。

1.4觀察指標(biāo) ①第2次激發(fā)后24h和治療7d后觀察各組小鼠激發(fā)部位皮膚的形態(tài)變化。②采用微測量卡尺測量誘發(fā)前、誘發(fā)后24h和治療7d后小鼠右耳中部的厚度。③各組末次灌胃24h后處死，摘眼球取血，靜置5min后，12000r/min離心分離血清，采用ELISA法測定血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α水平；同時(shí)立即剪下小鼠右耳廓, 使用直徑0.6cm的金屬打孔器在右耳中部打孔，取一定耳組織進(jìn)行常規(guī)HE染色，切片，光鏡下計(jì)算每視野中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)整體比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率和構(gòu)成比等相對數(shù)進(jìn)行描述，采用2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組皮膚形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 第2次激發(fā)后24h，與正常對照組比較，各模型組小鼠腹部激發(fā)部位皮損發(fā)紅、輕度水腫伴滲出；組織病理結(jié)果顯示，表皮角化過度、增厚，顆粒層及棘層肥厚，細(xì)胞間與細(xì)胞內(nèi)輕度水腫，真皮層炎癥細(xì)胞浸潤，真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張、增生，符合小鼠ACD皮損與組織病理學(xué)典型表現(xiàn)。小鼠右耳腫脹、充血，血管擴(kuò)張，組織病理顯示表皮角化過度，表皮細(xì)胞間水腫，發(fā)現(xiàn)較多單一核細(xì)胞浸潤；真皮結(jié)締組織水腫，血管周圍可見輕度細(xì)胞浸潤。治療7d后，頭花蓼低濃度組小鼠腹部皮損仍可見少量結(jié)痂，角質(zhì)層角化正常，炎癥細(xì)胞有所減少；頭花蓼中濃度組小鼠腹部皮損處較正常組小鼠皮膚略厚，仍可見少量丘疹，滲出、結(jié)痂消失，角質(zhì)層角化正常，炎癥細(xì)胞明顯減少；頭花蓼高濃度組、地塞米松組小鼠腹部皮損處皮膚恢復(fù)正常，潮紅、滲出、結(jié)痂均消失，表皮與正常小鼠相比厚度基本相當(dāng)，真皮層無炎癥細(xì)胞。

2.2各組誘發(fā)前后右耳厚度比較 誘發(fā)前各組小鼠右耳厚度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；誘發(fā)后24h，模型組、頭花蓼低濃度組、頭花蓼中濃度組、頭花蓼高濃度組、地塞米松組小鼠右耳厚度大于正常對照組(P均<0.05)；治療7d后，頭花蓼低濃度組、頭花蓼中濃度組、頭花蓼高濃度組、地塞米松組小鼠右耳厚度均低于模型組(P<0.05)，頭花蓼中濃度組低于頭花蓼低濃度組(P<0.05)，頭花蓼高濃度組低于頭花蓼中濃度組(P<0.05)。見表1。

表1 各組誘發(fā)前后右耳厚度比較

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與誘發(fā)后24h比較，P<0.05；④與頭花蓼低濃度組比較，P<0.05；⑤與頭花蓼高濃度組比較，P<0.05。

2.3各組右耳中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 頭花蓼低濃度組、頭花蓼中濃度組、頭花蓼高濃度組、地塞米松組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.05)，頭花蓼高濃度組、地塞米松組明顯低于頭花蓼低濃度組和頭花蓼中濃度組(P均<0.05)，頭花蓼中濃度組明顯低于頭花蓼低濃度組(P均<0.05)，地塞米松組明顯低于頭花蓼高濃度組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組右耳中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)比較

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與頭花蓼低濃度組比較，P<0.05；④與頭花蓼中濃度組比較，P<0.05；⑤與頭花蓼高濃度組比較，P<0.05。

2.4各組血清IL-4、IFN-γ和TNF-α水平比較 頭花蓼低濃度組、頭花蓼中濃度組、頭花蓼高濃度組、地塞米松組血清IL-4、TNF-α水平均低于模型組(P均<0.05)，頭花蓼高濃度組、地塞米松組低于頭花蓼低濃度組、頭花蓼中濃度組(P均<0.05)，頭花蓼中濃度組低于頭花蓼低濃度組(P均<0.05)，地塞米松組低于頭花蓼高濃度組(P均<0.05)；各組間IFN-γ水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

3 討 論

ACD是以T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，是一種以單核細(xì)胞浸潤及組織細(xì)胞損害為主要病理特征的炎性反應(yīng)。Th1與Th2細(xì)胞失衡是變態(tài)反應(yīng)類疾病發(fā)病過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，正常情況下，兩者通過各自分泌的細(xì)胞因子(Th1型細(xì)胞因子包括IL-2、TNF-α、IFN-γ等；Th2型細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10等)的相互抑制作用而處于動態(tài)平衡[9]。一旦在某些因素的作用下，Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間的平衡狀態(tài)被打破，則會導(dǎo)致包括過敏性皮膚病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生，其中Th2占優(yōu)勢是ACD發(fā)病的重要機(jī)制之一[10]。

表3 各組血清IL-4、IFN-γ和TNF-α水平比較

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與頭花蓼低濃度組比較，P<0.05；④與頭花蓼中濃度組比較，P<0.05；⑤與頭花蓼高濃度組比較，P<0.05。

目前對于ACD的研究報(bào)道較多，但運(yùn)用頭花蓼治療ACD的報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，ACD小鼠經(jīng)頭花蓼治療后，皮損部位形態(tài)基本恢復(fù)正常，皮膚角質(zhì)層明顯變薄，表皮厚度接近正常，毛囊結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，真皮層中中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞顯著減少，且血清IL-4和TNF-α水平顯著降低，同時(shí)，上述效應(yīng)隨著頭花蓼濃度的增加逐漸增強(qiáng)。表明頭花蓼對ACD具有明顯的治療作用。

頭花蓼治療ACD的機(jī)制可能為：頭花蓼富含的黃酮類化合物和沒食子酸類化合物具有抗炎、抗氧化和抗突變等生物活性，能夠明顯抑制TNF-α及IL-4的升高[11-12]。而TNF-α主要由Th1細(xì)胞分泌，它在ACD的發(fā)病過程中發(fā)揮著促進(jìn)炎性反應(yīng)、改變血管內(nèi)皮通透性、增加滲出等作用[13]。IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，其能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子-1以及嗜酸細(xì)胞活化趨化因子基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞遷移至皮損，嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒釋放嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP) 等炎癥遞質(zhì)促進(jìn)ACD的炎癥反應(yīng)[14]。頭花蓼通過抑制IL-4和TNF-α的水平，從而抑制炎性反應(yīng)，對ACD產(chǎn)生治療作用。

綜上所述，頭花蓼能夠降低IL-4和TNF-α水平，從而對ACD小鼠產(chǎn)生明顯的治療作用，值得進(jìn)一步進(jìn)行臨床應(yīng)用研究。

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Study on effect and mechanism of Polygonum capitatum on allergic contact dermatitis in mice

ZHANG Wei1, YU Shanshan2, CHEN Aiming1

(1.The First People’s Hospital of Suzhou City, Suzhou 215006, Jiangsu, China; 2.Tongzhou District people’s Hospital of Nantong City, Nantong 226300, Jiangsu, China)

Objective It is to observe the effect and mechanism of Polygonum capitatum on allergic contact dermatitis (ACD) of mouse model.Methods Thirty-six BALB/c mice were randomly divided into normal group, model group, Polygonum capitatum low does group, middle does group and high does group, and dexamethasone group, 6cases in each group.Except the normal group, the ACD models were induced on the abdomen and ear with Fluorescein isothiocyanate in the other groups.The second day of successful model, the animals in Polygonum capitatum low does group, middle does group and high dose group were intragastriced administration with 2.5%, 5% and 10% Polygonum capitatum solution for 0.4mL respectively, and with 0.4mL dexamethasone in dexamethasone group, treatment for 7days.The effect and mechanism of Polygonum capitatum were evaluated by form lesions, pathological changes in tissue and the levels of serum interleukin-4(IL-4), interferon -γ (IFN-γ) and tumor necrosis factor (TNF-α) in mice.Results After seven days of treatment, the lesions form and histopathological of Polygonum capitatum low does group, middle does group and high does group, and dexamethasone group were improved significantly compared with that before treatment.Compared with the model group, the right ear thickness, neutrophil, monocytes, serum IL-4and TNF-α were significantly lower in groups of Polygonum capitatum low does, middle does, high does group and dexamethasone group (allP<0.05), but there was no significance difference in serum IFN-γ levels (allP>0.05).Conclusion Polygonum capitatum has significant therapeutic effect on ACD, this may be related to lower the levels of IL-4and TNF-α.

Polygonum capitatum; allergic contact dermatitis; mouse

張偉，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槠つw病與性病學(xué)。

陳愛明，E-mail:china2006angela@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.18.007

R-332

A

1008-8849(2015)18-1958-04

2014-09-20