毛姍姍 沈玨 邱蕓香

圍生期甲狀腺功能減退對新生仔鼠心肌細胞自噬的影響

毛姍姍 沈玨 邱蕓香

目的 探討心肌細胞自噬在仔鼠圍生期甲狀腺功能減退（簡稱甲減）致心功能損害中的作用，并觀察左旋甲狀腺素（L-T4）替代治療后自噬指標(biāo)的改變。方法 SD孕鼠自孕15d起每日予丙基硫氧嘧啶（PTU）50mg/d灌胃至仔鼠出生并持續(xù)整個哺乳期，制成圍生期甲減模型，出生仔鼠為甲減組，其余孕鼠每日予0.9%氯化鈉溶液灌胃，出生仔鼠為對照組，部分甲減仔鼠自出生當(dāng)日起予以每日腹腔注射L-T4 2μg/100g，為治療組，收集甲減組、治療組及對照組（每組8只）出生7d齡仔鼠的心室肌組織，采用Western b lot法測定并比較心肌組織自噬相關(guān)蛋白LC3與cathepsin D的表達，同時測定并比較血清甲狀腺激素水平及CK-MB、LDH與AST水平。結(jié)果 甲減組仔鼠CK-MB、LDH及AST水平均高于對照組（均P＜0.01），治療組仔鼠3者水平均較甲減組下降（均P＜0.01）；甲減組仔鼠LC3II/LC3I及cathepsin D表達水平均高于對照組（均P＜0.01），治療組仔鼠2者的表達水平均較甲減組降低（均P＜0.01）。結(jié)論 心肌細胞自噬在圍生期甲減誘發(fā)新生仔鼠心功能損害中起重要作用。

甲狀腺功能減退癥 自噬 微管相關(guān)蛋白LC3 新生大鼠

圍生期甲狀腺激素水平對小兒多個器官的發(fā)育、代謝和功能調(diào)控起著重要作用，近年來有關(guān)先天性甲狀腺功能減退癥（congenital hypothyroidism，CH）對兒童心血管系統(tǒng)的影響逐漸受到關(guān)注，我們前期的研究已證實CH新生兒可出現(xiàn)心臟收縮、舒張功能損害，通過早期左旋甲狀腺素（L-T4）替代治療可逆轉(zhuǎn)受損心功能[1-2]。

自噬性程序性細胞死亡（簡稱自噬）是指細胞在胞內(nèi)通過溶酶體降解途徑消化其自身成分的過程。近年來越來越多的報道證實，自噬參與了多種原因?qū)е滦墓δ軗p害的過程[3-4]。我們前期的動物實驗發(fā)現(xiàn)圍生期甲狀腺功能減退（簡稱甲減）可通過改變心肌肌漿網(wǎng)相關(guān)的鈣轉(zhuǎn)運蛋白如Ca2+-ATP酶（SERCA2a）與磷酸受納蛋白（PLB）等基因轉(zhuǎn)錄，以調(diào)控新生仔鼠心功能損害的相關(guān)機制[5]。目前圍生期甲減致心功能損害的具體方式未知，心肌細胞自噬是否參與該過程尚待進一步明確。本實驗通過建立圍生期甲減及甲狀腺素替代治療新生仔鼠模型，測定自噬相關(guān)蛋白如微管相關(guān)蛋白LC3與cathepsin D的表達，旨在探討心肌細胞自噬在圍生期甲減誘發(fā)心功能損害中的作用以及甲狀腺素替代治療的反應(yīng)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與主要試劑 清潔級SD懷孕大鼠15只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，體重295~ 342g，喂飼普通飼料，自由飲水和進食，自然節(jié)律采光。丙基硫氧嘧啶（PTU）由南通精華制藥有限公司生產(chǎn)；L-T4由美國Sigma公司生產(chǎn)；游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）試劑盒由美國DPC公司生產(chǎn)，CK-MB、LDH和AST試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；自噬相關(guān)蛋白兔抗鼠LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ多克隆抗體由美國Abcam公司生產(chǎn)，兔抗鼠cathepsin D單克隆抗體由美國Abcam公司生產(chǎn)，二抗由美國Santa Cruz公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備和分組[6]11只SD孕鼠自孕15d起每日予以PTU（50mg/d）灌胃至仔鼠出生并持續(xù)整個哺乳期，出生仔鼠51只為甲減仔鼠，采用隨機數(shù)字表法抽取27只為甲減組；余24只自出生當(dāng)日起每日腹腔注射L-T4 2μg/100g，為治療組。另4只孕鼠每日予0.9%氯化鈉溶液灌胃，出生仔鼠21只為對照組。甲減組仔鼠及對照組仔鼠同時予以腹腔注射假手術(shù)。飼養(yǎng)7d后每組取8只，稱體重后斷頭處死，并立即開胸取出心臟置于冰0.9%氯化鈉溶液中，剪去心房、腱索及脂肪組織，并洗凈血液，濾紙吸干水分，稱心室凈重后立即放至液氮中凍存。

1.2.2 血清甲狀腺激素、心肌酶譜水平測定 分離各組仔鼠血清，采用天津德普（生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的IMMULITE全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒測定血清FT3、FT4和TSH水平。分離各組仔鼠血清，全自動生化分析儀及配套試劑盒測定血清CKMB、LDH和AST水平。

1.2.3 自噬相關(guān)蛋白的檢測 采用Western blot法檢測心肌組織LC3與cathepsin D的表達。取仔鼠心肌組織，4℃冰上組織勻漿裂解后，14 000r/min離心5 min，取上清液后提取大鼠心肌總蛋白，采用Bradford法進行蛋白定量。經(jīng)SDSPAGE膠電泳分離蛋白、PVDF膜轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、以1∶1 000加入一抗孵育、4℃過夜，經(jīng)TBST漂洗后37℃二抗孵育1h，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，用NIH Scion Image軟件分析目的蛋白與內(nèi)參β-actin之比值的相對灰度值，以表示蛋白的相對表達水平。LC3的表達水平用LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比率（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組仔鼠血清甲狀腺激素水平的比較 見表1。

表1 各組仔鼠血清甲狀腺激素水平的比較

由表1可見，甲減組血清FT4水平接近藥盒檢測底限（2.8pmol/L），低于對照組（P＜0.01），血清FT3水平較對照組降低（P＜0.01），血清TSH水平較對照組升高（P＜0.01）；治療組血清FT4、FT3水平均較甲減組升高（均P＜0.01），而血清TSH水平下降（P＜0.01）；治療組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 各組仔鼠血清心肌酶譜水平的比較 見表2。

表2 各組仔鼠心肌酶譜水平的比較（U/L）

由表2可見，甲減組血清CK-MB、LDH及AST水平均高于對照組（均P＜0.05）；治療組心肌酶譜水平均低于甲減組（均P＜0.05）；治療組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 各組仔鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白的比較 見表3。

表3 各組仔鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白的比較（灰度值）

由表3可見，甲減組仔鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、cathepsin D均高于對照組（均P＜0.01），治療組仔鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、cathepsin D較甲減組均降低（均P＜0.01），與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

CH是兒科較常見的一種內(nèi)分泌疾病，由于其圍生期甲狀腺激素減少，可對出生患兒的生長和智力發(fā)育造成嚴重影響[7]。圍生期甲減是由胎兒甲狀腺發(fā)育不良或者孕母甲狀腺激素缺乏引起，出生患兒即表現(xiàn)為CH。本研究通過孕鼠服用抗甲狀腺激素藥物PTU制備圍生期甲減動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲減組仔鼠血清FT3、FT4下降，TSH升高，同時部分出生甲減仔鼠予以L-T4治療，治療后仔鼠血清甲狀腺激素水平顯著上升，替代治療對恢復(fù)甲狀腺功能有顯著效果，提示模型制備成功。

心臟是甲狀腺激素作用的主要靶器官之一，CH患兒在新生兒期即可出現(xiàn)心臟收縮和舒張功能損傷，早期給予甲狀腺素替代治療后受損心功能可得到逆轉(zhuǎn)[1]。本研究結(jié)果顯示，甲減組新生仔鼠心肌酶譜CK-MB、LDH及AST水平均較對照組顯著升高，經(jīng)早期L-T4治療后可降至接近正常水平，從而進一步證實圍生期甲減所致心功能損害以及早期甲狀腺素的有效替代治療作用。我們之前的研究表明，CH引起以上心功能改變的機制可能與相關(guān)鈣轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控心肌細胞內(nèi)鈣超載相關(guān)[5]，然而最終導(dǎo)致細胞損傷和細胞死亡的方式尚有待探究。

心肌細胞的功能有賴于在復(fù)雜的調(diào)控下達到內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，自噬作為細胞死亡的其中一種調(diào)控方式，在維持心肌細胞新陳代謝中起到重要作用。自噬又稱自體吞噬，當(dāng)機體處在病理條件下，如鈣超載、缺血缺氧等，細胞可啟動自噬以清除受損的線粒體，保證正常細胞的存活，并分解細胞器獲得補充能量。然而，大量自噬仍可導(dǎo)致過多的細胞自我消化，造成不可逆的細胞損害與細胞死亡。微管相關(guān)蛋白LC3是參與自噬小體膜形成的泛素樣調(diào)節(jié)蛋白，同時也是是哺乳動物細胞中自噬發(fā)生的重要標(biāo)記物。LC3蛋白分為Ⅰ型游離型和Ⅱ型膜結(jié)合型，自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ型轉(zhuǎn)化，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ常作為定量分析自噬的重要指標(biāo)。另一個自噬相關(guān)蛋白cathepsin D，也常作為評價細胞自噬激活的程度[8]。cathepsin D是一種水解酶，在溶酶體中降解損壞的蛋白質(zhì)，參與細胞自噬的過程。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)圍生期甲減新生仔鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及cathepsin D的表達均顯著增強，說明心肌細胞自噬參與圍生期甲狀腺激素減少致心功能損傷過程。經(jīng)LT4早期替代治療后，兩者表達均顯著下降，提示甲狀腺素替代治療可通過增加甲狀腺功能，調(diào)控心肌細胞自噬水平，減輕心肌損傷，從而最終改善心功能。結(jié)合我們的前期研究，我們推測圍生期甲減可下調(diào)心肌肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運蛋白活性，造成鈣離子轉(zhuǎn)運障礙，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載，從而誘導(dǎo)心肌細胞自噬發(fā)生。這一系列調(diào)控改變可能為CH引起新生兒心臟收縮和舒張功能損害的提供重要分子機制研究。目前，調(diào)節(jié)該過程的具體分子機制或信號通路尚不清楚，仍需進一步探索，這將是我們下一步研究的方向，為圍生期甲減性致心臟損害的病理生理學(xué)研究及其預(yù)防、治療方法的改進提供新的思路。

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Alteration of cardiomyocyte autophagy in neonatal hypothyroid rats

MAO Shanshan,SHEN Jue,QIU Yunxiang.Department of Pediatrics,the Children's Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310003,China

Hypothyroidism Autophagy Microtubule-associated p rotein LC3 Neonatalrat

2014-12-25）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省教育廳科研項目（Y201019211）；浙江省人口計劃生育科研項目（201493583）

310003杭州,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院兒內(nèi)科

毛姍姍，E-mail：maoshanshan33@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the alteration of cardiomyocyte autophagy in neonatal hypothyroid rats. Methods Hypothyroidism was induced by gavage of propylthiouracil(PTU,50mg/d)solution from embryonic d15 through the lactational period in pregnant SD rats.The offspring of hypothyroid rats was divided into two groups:in L-T4 treatment group(n=8)the neonatal rats received intraperitoneal injection of levothroxine(L-T4,2μg/100g.d)starting from the day of birth;in hypothyroid group(n=8)the neonatalrats received normal saline instead of L-T4.The offspring of normal pregnant rats served as control group (n=8).Animals were sacrificed at postnatal d 7.Serum thyroid hormone levels and myocadial enzymes CK-MB,LDH and AST were measured;LC3I,LC3II and cathepsin D protein levels were detected by Western blotting. Results Hypothyroid neonatal rats had significant higher myocardial CK-MB,LDH and AST levels than those in control group(P＜0.01),while those indicators were significantly decreased in L-T4 treatment group compared to hypothyroid group.Compared with control group,LC3I,LC3IIand cathepsin D p rotein levels were significantly higher(P＜0.01)in neonatalhypothyroid group(P＜0.01),while L-T4 treatmentg roup showed a significant decrease compared w ith hypothyroid group(P＜0.01). Conclusion Cardiomyocyte autophagy may be involved in the pathogenesis ofmyocardialsystolic and diastolic dysfunc tion in hypothyroidism neonatal rats.