毛姍姍 沈玨 邱蕓香

圍生期甲狀腺功能減退對(duì)新生仔鼠心肌細(xì)胞自噬的影響

毛姍姍 沈玨 邱蕓香

目的 探討心肌細(xì)胞自噬在仔鼠圍生期甲狀腺功能減退（簡(jiǎn)稱甲減）致心功能損害中的作用，并觀察左旋甲狀腺素（L-T4）替代治療后自噬指標(biāo)的改變。方法 SD孕鼠自孕15d起每日予丙基硫氧嘧啶（PTU）50mg/d灌胃至仔鼠出生并持續(xù)整個(gè)哺乳期，制成圍生期甲減模型，出生仔鼠為甲減組，其余孕鼠每日予0.9%氯化鈉溶液灌胃，出生仔鼠為對(duì)照組，部分甲減仔鼠自出生當(dāng)日起予以每日腹腔注射L-T4 2μg/100g，為治療組，收集甲減組、治療組及對(duì)照組（每組8只）出生7d齡仔鼠的心室肌組織，采用Western b lot法測(cè)定并比較心肌組織自噬相關(guān)蛋白LC3與cathepsin D的表達(dá)，同時(shí)測(cè)定并比較血清甲狀腺激素水平及CK-MB、LDH與AST水平。結(jié)果 甲減組仔鼠CK-MB、LDH及AST水平均高于對(duì)照組（均P＜0.01），治療組仔鼠3者水平均較甲減組下降（均P＜0.01）；甲減組仔鼠LC3II/LC3I及cathepsin D表達(dá)水平均高于對(duì)照組（均P＜0.01），治療組仔鼠2者的表達(dá)水平均較甲減組降低（均P＜0.01）。結(jié)論 心肌細(xì)胞自噬在圍生期甲減誘發(fā)新生仔鼠心功能損害中起重要作用。

甲狀腺功能減退癥 自噬 微管相關(guān)蛋白LC3 新生大鼠

圍生期甲狀腺激素水平對(duì)小兒多個(gè)器官的發(fā)育、代謝和功能調(diào)控起著重要作用，近年來有關(guān)先天性甲狀腺功能減退癥（congenital hypothyroidism，CH）對(duì)兒童心血管系統(tǒng)的影響逐漸受到關(guān)注，我們前期的研究已證實(shí)CH新生兒可出現(xiàn)心臟收縮、舒張功能損害，通過早期左旋甲狀腺素（L-T4）替代治療可逆轉(zhuǎn)受損心功能[1-2]。

自噬性程序性細(xì)胞死亡（簡(jiǎn)稱自噬）是指細(xì)胞在胞內(nèi)通過溶酶體降解途徑消化其自身成分的過程。近年來越來越多的報(bào)道證實(shí)，自噬參與了多種原因?qū)е滦墓δ軗p害的過程[3-4]。我們前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)圍生期甲狀腺功能減退（簡(jiǎn)稱甲減）可通過改變心肌肌漿網(wǎng)相關(guān)的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如Ca2+-ATP酶（SERCA2a）與磷酸受納蛋白（PLB）等基因轉(zhuǎn)錄，以調(diào)控新生仔鼠心功能損害的相關(guān)機(jī)制[5]。目前圍生期甲減致心功能損害的具體方式未知，心肌細(xì)胞自噬是否參與該過程尚待進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立圍生期甲減及甲狀腺素替代治療新生仔鼠模型，測(cè)定自噬相關(guān)蛋白如微管相關(guān)蛋白LC3與cathepsin D的表達(dá)，旨在探討心肌細(xì)胞自噬在圍生期甲減誘發(fā)心功能損害中的作用以及甲狀腺素替代治療的反應(yīng)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)SD懷孕大鼠15只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重295~ 342g，喂飼普通飼料，自由飲水和進(jìn)食，自然節(jié)律采光。丙基硫氧嘧啶（PTU）由南通精華制藥有限公司生產(chǎn)；L-T4由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）試劑盒由美國(guó)DPC公司生產(chǎn)，CK-MB、LDH和AST試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；自噬相關(guān)蛋白兔抗鼠LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ多克隆抗體由美國(guó)Abcam公司生產(chǎn)，兔抗鼠cathepsin D單克隆抗體由美國(guó)Abcam公司生產(chǎn)，二抗由美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備和分組[6]11只SD孕鼠自孕15d起每日予以PTU（50mg/d）灌胃至仔鼠出生并持續(xù)整個(gè)哺乳期，出生仔鼠51只為甲減仔鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取27只為甲減組；余24只自出生當(dāng)日起每日腹腔注射L-T4 2μg/100g，為治療組。另4只孕鼠每日予0.9%氯化鈉溶液灌胃，出生仔鼠21只為對(duì)照組。甲減組仔鼠及對(duì)照組仔鼠同時(shí)予以腹腔注射假手術(shù)。飼養(yǎng)7d后每組取8只，稱體重后斷頭處死，并立即開胸取出心臟置于冰0.9%氯化鈉溶液中，剪去心房、腱索及脂肪組織，并洗凈血液，濾紙吸干水分，稱心室凈重后立即放至液氮中凍存。

1.2.2 血清甲狀腺激素、心肌酶譜水平測(cè)定 分離各組仔鼠血清，采用天津德普（生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的IMMULITE全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒測(cè)定血清FT3、FT4和TSH水平。分離各組仔鼠血清，全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑盒測(cè)定血清CKMB、LDH和AST水平。

1.2.3 自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)心肌組織LC3與cathepsin D的表達(dá)。取仔鼠心肌組織，4℃冰上組織勻漿裂解后，14 000r/min離心5 min，取上清液后提取大鼠心肌總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)SDSPAGE膠電泳分離蛋白、PVDF膜轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、以1∶1 000加入一抗孵育、4℃過夜，經(jīng)TBST漂洗后37℃二抗孵育1h，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，用NIH Scion Image軟件分析目的蛋白與內(nèi)參β-actin之比值的相對(duì)灰度值，以表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。LC3的表達(dá)水平用LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比率（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組仔鼠血清甲狀腺激素水平的比較 見表1。

表1 各組仔鼠血清甲狀腺激素水平的比較

由表1可見，甲減組血清FT4水平接近藥盒檢測(cè)底限（2.8pmol/L），低于對(duì)照組（P＜0.01），血清FT3水平較對(duì)照組降低（P＜0.01），血清TSH水平較對(duì)照組升高（P＜0.01）；治療組血清FT4、FT3水平均較甲減組升高（均P＜0.01），而血清TSH水平下降（P＜0.01）；治療組與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 各組仔鼠血清心肌酶譜水平的比較 見表2。

表2 各組仔鼠心肌酶譜水平的比較（U/L）

由表2可見，甲減組血清CK-MB、LDH及AST水平均高于對(duì)照組（均P＜0.05）；治療組心肌酶譜水平均低于甲減組（均P＜0.05）；治療組與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 各組仔鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白的比較 見表3。

表3 各組仔鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白的比較（灰度值）

由表3可見，甲減組仔鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、cathepsin D均高于對(duì)照組（均P＜0.01），治療組仔鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、cathepsin D較甲減組均降低（均P＜0.01），與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

CH是兒科較常見的一種內(nèi)分泌疾病，由于其圍生期甲狀腺激素減少，可對(duì)出生患兒的生長(zhǎng)和智力發(fā)育造成嚴(yán)重影響[7]。圍生期甲減是由胎兒甲狀腺發(fā)育不良或者孕母甲狀腺激素缺乏引起，出生患兒即表現(xiàn)為CH。本研究通過孕鼠服用抗甲狀腺激素藥物PTU制備圍生期甲減動(dòng)物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲減組仔鼠血清FT3、FT4下降，TSH升高，同時(shí)部分出生甲減仔鼠予以L-T4治療，治療后仔鼠血清甲狀腺激素水平顯著上升，替代治療對(duì)恢復(fù)甲狀腺功能有顯著效果，提示模型制備成功。

心臟是甲狀腺激素作用的主要靶器官之一，CH患兒在新生兒期即可出現(xiàn)心臟收縮和舒張功能損傷，早期給予甲狀腺素替代治療后受損心功能可得到逆轉(zhuǎn)[1]。本研究結(jié)果顯示，甲減組新生仔鼠心肌酶譜CK-MB、LDH及AST水平均較對(duì)照組顯著升高，經(jīng)早期L-T4治療后可降至接近正常水平，從而進(jìn)一步證實(shí)圍生期甲減所致心功能損害以及早期甲狀腺素的有效替代治療作用。我們之前的研究表明，CH引起以上心功能改變的機(jī)制可能與相關(guān)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載相關(guān)[5]，然而最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡的方式尚有待探究。

心肌細(xì)胞的功能有賴于在復(fù)雜的調(diào)控下達(dá)到內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，自噬作為細(xì)胞死亡的其中一種調(diào)控方式，在維持心肌細(xì)胞新陳代謝中起到重要作用。自噬又稱自體吞噬，當(dāng)機(jī)體處在病理?xiàng)l件下，如鈣超載、缺血缺氧等，細(xì)胞可啟動(dòng)自噬以清除受損的線粒體，保證正常細(xì)胞的存活，并分解細(xì)胞器獲得補(bǔ)充能量。然而，大量自噬仍可導(dǎo)致過多的細(xì)胞自我消化，造成不可逆的細(xì)胞損害與細(xì)胞死亡。微管相關(guān)蛋白LC3是參與自噬小體膜形成的泛素樣調(diào)節(jié)蛋白，同時(shí)也是是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自噬發(fā)生的重要標(biāo)記物。LC3蛋白分為Ⅰ型游離型和Ⅱ型膜結(jié)合型，自噬發(fā)生時(shí)，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ型轉(zhuǎn)化，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ常作為定量分析自噬的重要指標(biāo)。另一個(gè)自噬相關(guān)蛋白cathepsin D，也常作為評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬激活的程度[8]。cathepsin D是一種水解酶，在溶酶體中降解損壞的蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞自噬的過程。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)圍生期甲減新生仔鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及cathepsin D的表達(dá)均顯著增強(qiáng)，說明心肌細(xì)胞自噬參與圍生期甲狀腺激素減少致心功能損傷過程。經(jīng)LT4早期替代治療后，兩者表達(dá)均顯著下降，提示甲狀腺素替代治療可通過增加甲狀腺功能，調(diào)控心肌細(xì)胞自噬水平，減輕心肌損傷，從而最終改善心功能。結(jié)合我們的前期研究，我們推測(cè)圍生期甲減可下調(diào)心肌肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，造成鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬發(fā)生。這一系列調(diào)控改變可能為CH引起新生兒心臟收縮和舒張功能損害的提供重要分子機(jī)制研究。目前，調(diào)節(jié)該過程的具體分子機(jī)制或信號(hào)通路尚不清楚，仍需進(jìn)一步探索，這將是我們下一步研究的方向，為圍生期甲減性致心臟損害的病理生理學(xué)研究及其預(yù)防、治療方法的改進(jìn)提供新的思路。

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Alteration of cardiomyocyte autophagy in neonatal hypothyroid rats

MAO Shanshan,SHEN Jue,QIU Yunxiang.Department of Pediatrics,the Children's Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310003,China

Hypothyroidism Autophagy Microtubule-associated p rotein LC3 Neonatalrat

2014-12-25）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201019211）；浙江省人口計(jì)劃生育科研項(xiàng)目（201493583）

310003杭州,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院兒內(nèi)科

毛姍姍，E-mail：maoshanshan33@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the alteration of cardiomyocyte autophagy in neonatal hypothyroid rats. Methods Hypothyroidism was induced by gavage of propylthiouracil(PTU,50mg/d)solution from embryonic d15 through the lactational period in pregnant SD rats.The offspring of hypothyroid rats was divided into two groups:in L-T4 treatment group(n=8)the neonatal rats received intraperitoneal injection of levothroxine(L-T4,2μg/100g.d)starting from the day of birth;in hypothyroid group(n=8)the neonatalrats received normal saline instead of L-T4.The offspring of normal pregnant rats served as control group (n=8).Animals were sacrificed at postnatal d 7.Serum thyroid hormone levels and myocadial enzymes CK-MB,LDH and AST were measured;LC3I,LC3II and cathepsin D protein levels were detected by Western blotting. Results Hypothyroid neonatal rats had significant higher myocardial CK-MB,LDH and AST levels than those in control group(P＜0.01),while those indicators were significantly decreased in L-T4 treatment group compared to hypothyroid group.Compared with control group,LC3I,LC3IIand cathepsin D p rotein levels were significantly higher(P＜0.01)in neonatalhypothyroid group(P＜0.01),while L-T4 treatmentg roup showed a significant decrease compared w ith hypothyroid group(P＜0.01). Conclusion Cardiomyocyte autophagy may be involved in the pathogenesis ofmyocardialsystolic and diastolic dysfunc tion in hypothyroidism neonatal rats.