蔣建新,成為榮,徐 西,楊 涌

(1. 廣西桂林市精神衛(wèi)生中心,廣西 桂林 541001；2. 江蘇省南京腦科醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

CUMS所致大鼠抑郁行為的性別差異與HPA軸功能及BDNF表達(dá)相關(guān)性研究

蔣建新1,成為榮2,徐 西2,楊 涌1

(1. 廣西桂林市精神衛(wèi)生中心,廣西 桂林 541001；2. 江蘇省南京腦科醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

目的 探討慢性輕度不可預(yù)見性刺激(CUMS)所致大鼠抑郁行為性別差異與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)的相關(guān)性。方法 選擇雌雄各半的遠(yuǎn)交群SD大鼠64只，以隨機(jī)數(shù)字表格法為分配依據(jù)分雌性對照組、雄性對照組、雌性模型組以及雄性模型組，每組16只。應(yīng)用CUMS以及孤養(yǎng)模式來建立大鼠抑郁模型。應(yīng)用糖水消耗及高架迷宮法評估大鼠抑郁行為程度，應(yīng)用Western-blot法檢測下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)mRNA蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平，應(yīng)用熒光定量PCR法檢測大鼠海馬BDNF mRNA蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平，應(yīng)用放射免疫法檢測大鼠血清皮質(zhì)酮(CORT)含量。結(jié)果 雌性模型組與雄性模型組高架迷宮開放臂次數(shù)、開放臂停留時(shí)間、糖水偏愛率、向下探究次數(shù)均顯著少于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)，血清CORT含量、下丘腦CRF mRNA蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)，而大鼠海馬BDNF mRNA蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平則明顯低于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)。雄性模型組大鼠進(jìn)入高架迷宮開放臂與關(guān)閉臂次數(shù)、中央停留時(shí)間、糖水偏愛率、向下探究次數(shù)、血清CORT含量、下丘腦CRF mRNA蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平明顯低于雌性模型組(P均<0.05)，但關(guān)閉臂停留時(shí)間顯著長于雌性模型組(P<0.05)。結(jié)論 CUMS所致大鼠抑郁行為的性別差異與HPA軸功能及BDNF表達(dá)有密切關(guān)系，可為抑郁癥的防治及機(jī)制研究提供有力實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

大鼠；抑郁行為；下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

抑郁癥作為一種情感障礙性精神類疾病，具有高患病率以及高自殺率的特點(diǎn)，目前已經(jīng)成為了世界性的第四大類疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織的詳細(xì)統(tǒng)計(jì)，至2020年，抑郁癥會成為僅次于冠心病的世界第二大疾病[1]。流行病學(xué)的相關(guān)分析顯示，女性出現(xiàn)抑郁癥的概率要明顯高于男性，比例高達(dá)3∶1[2],目前抑郁癥性別差異的相關(guān)機(jī)制還不明確。近年研究發(fā)現(xiàn),抑郁癥與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(GRF)的分泌情況、血清皮質(zhì)酮(CORT)的含量升高以及下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸功能的失調(diào)均有關(guān)聯(lián)[3-4]。HPA軸功能亢進(jìn)患者，其腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)明顯升高[5]，可見BDNF以及HPA軸在抑郁癥的發(fā)病中有重要作用。本研究應(yīng)用慢性輕度不可預(yù)見性刺激(CUMS)方式建立大鼠模型，進(jìn)而探討抑郁行為的性別差異與HPA軸功能及BDNF表達(dá)的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步尋找性別差異機(jī)制及預(yù)防措施提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 動(dòng)物 清潔級遠(yuǎn)交群SD大鼠64只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量185～220 g。

1.2 試劑與儀器 蛋白定量BCA及蛋白裂解液購自博士德生物工程有限公司，CORT放射免疫試劑盒購自上海博研生物科技公司，山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG(均為HRP標(biāo)記)購自中杉金橋生物科技公司，兔抗鼠BDNF多克隆抗體以及ECL發(fā)光試劑盒分別購自美國的Milipore與Pierce公司，兔抗鼠CRF多克隆抗體與RNA抽提試劑盒分別購自美國的Abcam與OMEGA公司，凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀、微量核酸定量儀購自美國Biorad公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR購自日本TaKaRa公司。

1.3 動(dòng)物及分組模型 取雌雄各半的64只大鼠，自由飲水?dāng)z食，并在通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表格法將大鼠分為雌性對照組、雄性對照組、雌性模型組與雄性模型組，每組16只。保持正常的光照以及飲水?dāng)z食。雌性模型組與雄性模型組依照孤養(yǎng)以及CUMS方式建立抑郁模型，使用通宵與間歇照明法對大鼠進(jìn)行刺激，光照法的光暗周期為2 h/2 h，同時(shí)選擇2 h噪聲、1 min夾尾、40～50 V電擊3 min、在4 ℃冰水中游泳5 min、禁水禁食24 h以上、在熱環(huán)境下5 min以及保持鼠籠傾斜角度45°超過24 h等共11種刺激方法，每日要隨機(jī)安排1種，每種刺激要重復(fù)2～3次，且不可連續(xù)性地出現(xiàn)同種刺激，整個(gè)刺激實(shí)驗(yàn)周期為4周，在第29—30天分別進(jìn)行高架迷宮與糖水消耗實(shí)驗(yàn)。

1.4 大鼠行為學(xué)相關(guān)檢測

1.4.1 高架迷宮測試 高架迷宮的主要配件裝置包括底座(40 cm)、兩臂十字交叉(40 cm×10 cm)、中央格(10 cm×10 cm)，實(shí)驗(yàn)環(huán)境需要安靜且明暗要合適，將參選實(shí)驗(yàn)大鼠放進(jìn)中央?yún)^(qū)域，并注意頭部要朝向開放臂，隨后要詳細(xì)記錄下在5 min內(nèi)大鼠開放臂進(jìn)入次數(shù)以及關(guān)閉臂進(jìn)入次數(shù)，在開放臂、關(guān)閉臂及中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間，此外還有大鼠后肢的站立次數(shù)及開放臂向下探究的次數(shù)。

1.4.2 糖水消耗測試 在大鼠抑郁模型建立完成前，需要訓(xùn)練大鼠在24 h飲用糖水10 g/L及純凈水，訓(xùn)練成熟后可開始正式試驗(yàn)。首先要予以大鼠禁食禁水24 h，隨后將大鼠放置于單籠中，保持環(huán)境的安靜和明暗舒適，然后予以大鼠0.6 L純凈水與10 g/L糖水，觀察1 h后大鼠純凈水及糖水的消耗量并記錄下來，計(jì)算糖水偏愛率：糖水消耗/總液體消耗×100%。

1.5 血清CORT含量檢測 在各組中分別選取4只大鼠，取其靜脈血，3 000 r/min離心處理10 min，隨后將血清分離再于-20 ℃下保存，應(yīng)用血清CORT放射免疫試劑盒測定其含量。

1.6 下丘腦CRF mRNA及海馬BDNF mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測 在各組中分別隨機(jī)取4只大鼠，斷頭后取其腦組織、下丘腦與海馬，每100 mg腦組織中加入1 mL RNAstore，并將下丘腦與海馬浸泡于其中，4 ℃下過夜后棄掉液體，下丘腦與海馬組織保存于-80 ℃下備用。應(yīng)用熒光定量PCR法進(jìn)行檢測，引物的設(shè)計(jì)可參照在GenBank中登陸的CRF、BDNF以及內(nèi)參β-actin基因序列。大鼠海馬與下丘腦組織的總RNA可使用RNA抽提試劑盒進(jìn)行提取，隨后予以逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，并將其作為模板，行熒光定量PCR擴(kuò)增，最后記錄CRF與海馬BDNF基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.7 下丘腦CRF及海馬BDNF蛋白水平檢測 在各組中分別取4只大鼠，斷頭后取其腦組織，下丘腦與海馬分離，并將組織保存于-80 ℃下。應(yīng)用BCA法測定腦組織勻漿總蛋白，含量，取樣品蛋白30 μg，分離處理后將其轉(zhuǎn)移至NC膜上，在室溫下于脫脂奶粉中封閉1 h，分離后在1∶1 000稀釋的條件下加入兔抗鼠CRF及BDNF多克隆抗體，同時(shí)加入1∶5 000稀釋條件下的山羊抗鼠β-actin單克隆抗體，在4 ℃下過夜保存，室溫下TBST洗滌處理2次，加入山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠IgG(1∶3 000稀釋，均HRP標(biāo)記處理)。在室溫下孵育2 h，隨后應(yīng)用TBST洗滌2次，進(jìn)行ECL顯色處理，最后使用Bio-Rad凝膠成像儀攝取凝膠圖像，隨后予以吸光度分析。

2 結(jié) 果

2.1 高架迷宮測試結(jié)果 雌性模型組與雄性模型組大鼠迷宮開放臂進(jìn)入次數(shù)、開放臂停留時(shí)間以及向下探究次數(shù)均顯著少于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)，但關(guān)閉臂停留時(shí)間明顯長于雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)；雄性模型組大鼠迷宮開放臂以及關(guān)閉臂進(jìn)入次數(shù)、直立及向下探究次數(shù)、在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間均明顯少于雌性模型組(P均<0.05)，而關(guān)閉臂停留時(shí)間明顯長于雌性模型組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠的高架迷宮測試結(jié)果比較

注：①與雌性模型組比較，P<0.05；②與雄性模型組比較，P<0.05。

2.2 糖水消耗測試結(jié)果 雄性模型組糖水偏愛率為(28.22±35.33)%，雄性對照組為(84.98±9.10)%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-12.467，P<0.05)；雌性模型組糖水偏愛率為(72.73±13.05)%，雌性對照組為(88.54±2.73)%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.843，P<0.05)；且雄性模型組糖水偏愛率顯著低于雌性模型組(t=8.389，P<0.05)。

2.3 血清CORT含量測定結(jié)果 雌性模型組血清CORT含量為(331.36±24.16)ng/mL，雌性對照組為(304.14±4.58)ng/mL，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-13.675，P<0.05)；雄性模型組CORT含量為(296.56±8.16)ng/mL，雄性對照組為(269.89±4.43)ng/mL，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.733，P<0.05)。同時(shí)雌性模型組CORT含量明顯高于雄性模型組(t=-10.547，P<0.05)，雌性對照組CORT含量明顯高于雄性對照組(t=7.682，P<0.05)。

2.4 下丘腦CRF及海馬BDNF mRNA轉(zhuǎn)錄水平 雌性模型組與雄性模型組海馬BDNF mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于相對應(yīng)的雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)；而雌性模型組與雄性模型組下丘腦CRF mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于相對應(yīng)的雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)。雌性模型組下丘腦CRF mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于雄性模型組(P<0.05)，雌性模型組大鼠海馬BDNF mRNA轉(zhuǎn)錄水平亦明顯高于雄性模型組大鼠(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠下丘腦CRF mRNA及海馬BDNF mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

注：①與雌性模型組比較，P<0.05；②與雄性模型組比較，P<0.05。

2.5 下丘腦CRF及海馬BDNF蛋白表達(dá)情況 雌性模型組與雄性模型組海馬BDNF蛋白表達(dá)水平顯著低于相對應(yīng)的雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)；而雌性模型組與雄性模型組下丘腦CRF蛋白表達(dá)水平則明顯高于相對應(yīng)的雌性對照組與雄性對照組(P均<0.05)；雌性模型組下丘腦CRF蛋白表達(dá)水平高于雄性模型組(P<0.05)，而雌性模型組海馬BDNF蛋白表達(dá)水平亦明顯高于雄性模型組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠下丘腦CRF 及海馬BDNF 蛋白表達(dá)水平比較

注：①與雌性模型組比較，P<0.05；②與雄性模型組比較，P<0.05。

3 討 論

CUMS在當(dāng)前是十分典型的且比較常用的抑郁模型建立方法，抑郁癥的低水平、中慢性應(yīng)激源促使病情發(fā)生或者加速的機(jī)制是其主要理論參考依據(jù)[6-7]。因此本研究通過孤養(yǎng)并結(jié)合COMS模式來建立大鼠抑郁模型，結(jié)果顯示，COMS雄性與雌性模型大鼠在高架迷宮、糖水消耗測試中均明顯表現(xiàn)出了焦慮抑郁的行為，且高架迷宮開放臂進(jìn)入次數(shù)、開放臂停留時(shí)間以及向下探究次數(shù)雌性與雄性模型組大鼠明顯少于雌性與雄性對照組大鼠，可見模型組兩性大鼠的抑郁行為已經(jīng)十分明顯，同時(shí)雄性模型組大鼠迷宮開放臂以及關(guān)閉臂進(jìn)入次數(shù)、直立與向下探究次數(shù)、在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間較雌性模型組降低更為明顯，可見雄性模型組大鼠的抑郁行為更為顯著。另外，兩性模型組大鼠的糖水偏愛率要明顯低于對應(yīng)的對照組，且雄性模型組大鼠的糖水偏愛率較雌性模型組大鼠低，可見抑郁模型大鼠已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的興趣缺失，且雄性模型組大鼠的興趣缺失更為強(qiáng)烈，抑郁行為更加明顯。

HPA作為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要成分，一旦發(fā)生應(yīng)激情況，該軸的激活以及因此所引發(fā)的各種系列變化都是應(yīng)激反應(yīng)的重要特征。HPA軸亢進(jìn)是慢性應(yīng)激對機(jī)體造成損傷的一種重要體現(xiàn)和環(huán)節(jié)，其與抑郁癥的發(fā)生和進(jìn)展有著密不可分的關(guān)系。血清CORT及CRF大量的分泌是HPA軸亢進(jìn)的2個(gè)重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，兩性模型組血清含量明顯高于兩性對照組，且雌性模型組CORT含量高于雄性模型組，雌性模型組CRF表達(dá)高于雄性模型組，雌性對照組CRF表達(dá)高于雄性模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示女性抑郁癥的發(fā)病率要高于男性，這可能與女性患者CORT及CRF表達(dá)較高有關(guān)，

近年來的研究中發(fā)現(xiàn)，BDNF的表達(dá)有一定的抗抑郁作用，同時(shí)其在機(jī)體內(nèi)的水平也可以作為反映重度抑郁患者治療與預(yù)后的指標(biāo)[8]。在慢性應(yīng)激刺激下，大鼠海馬BDNF表達(dá)有所減少，從而減弱了其對HPA軸的抑制影響。本研究結(jié)果顯示，兩性對照組大鼠BDNF表達(dá)情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而兩性模型組BDNF表達(dá)較兩性對照組有所降低，可見CUMS對BDNF的表達(dá)有一定抑制作用，且雄性大鼠的BDNF表達(dá)水平明顯低于雌性大鼠，這可能與雄性大鼠抑郁行為重于雌性大鼠有關(guān)。

綜上所述，CUMS所致大鼠抑郁行為有明顯的性別差異，雄性大鼠明顯重于雌性大鼠，這與在接受應(yīng)激刺激時(shí)大鼠海馬BDNF表達(dá)程度不同及HPA軸功能差異有關(guān)，為臨床治療及預(yù)防抑郁癥提供了有價(jià)值的參考依據(jù)。

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Study on the correlation between the gender difference in depressive behavior of rats induced by CUMS and function of HPA axis and BDNF expression

JIANG Jianxin1, CHENG Weirong2, XU Xi2, YANG Yong1

(1.Guilin Mental Health Psychiatric Center, Guilin 541001, Guangxi, China; 2.Nanjing Brain Hospital, Nanjing 210029, Jiangsu, China)

Objective It is to investigate the correlation between the gender differences in depressive behavior of rats induced by CUMS and hypothalamic pituitary adrenal axis (HPA) and brain derived neurotrophic factor (BDNF) expression. Methods 64 case of each half of the male and female of outbred group SD rats were selected, and divided into 4 groups by using random number table method as female control group, male control group, female model group and male model group with 16 rats in each group. The rat model of depression was built by CUMS and isolated feed mode. The degree of the depressive behavior of rats was valued by sugar consumption and elevated maze method. The protein expression and transcription level of corticotrophin releasing factor (CRF) mRNA in hypothalamus were detected by Western-blot method. The protein expression and transcription level of Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) mRNA in hippocampus were detected by fluorescence quantitative PCR. The content of serum corticosterone (CORT) of rats was detected by radioimmunoassay. Results The number of into open arm, residence time in opened arm, sucrose preference rate and times of down inquiry of male and female model groups were significantly decreased than that of female and male control group (allP<0.05); and the content of serum CORT and hypothalamus CRF protein expression and transcription level of mRNA were increased significantly than that of female and male control groups (allP<0.05); while the rat hippocampus BDNF protein expression and transcription level of mRNA were significantly decreased than that of female and male control groups (allP<0.05). The times of into elevated maze opened arm and closed arm, the central residence time, sucrose preference rate, times of down inquiry, serum CORT content, hypothalamus CRF protein expression and transcription level of mRNA in male model group were significantly lower than that in female model group (allP<0.05); but the closed arm retention time was significantly longer than that in female model group (P<0.05). Conclusion The gender differences in depressive behavior of rats induced by CUMS have close relationship with the expression of HPA and BDNF axis function; it can provide strong experimental evidence for the prevention and cure and study of mechanism of depression.

rats; depressive behavior; Hypothalamus-pituitary-adrenal axis; brain derived neurotrophic factor

蔣建新，男，主治醫(yī)師，主要從事雙相情感障礙的臨床和基礎(chǔ)研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.008

R-332

A

1008-8849(2015)12-1276-04

2014-12-20