賈英民，李瑞玉，武密山，霍瑞樓，李 彬

(1. 北京軍區(qū)總醫(yī)院，北京 100700；2. 河北省平鄉(xiāng)縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 平鄉(xiāng) 054500；3. 邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054000；4. 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050090；5. 河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050051)

地黃梓醇對(duì)原代培養(yǎng)SD乳大鼠成骨細(xì)胞成骨活性的影響研究

賈英民1，2，李瑞玉3，武密山4，霍瑞樓2，李 彬5

(1. 北京軍區(qū)總醫(yī)院，北京 100700；2. 河北省平鄉(xiāng)縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 平鄉(xiāng) 054500；3. 邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054000；4. 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050090；5. 河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050051)

目的 觀察不同濃度地黃梓醇對(duì)體外培養(yǎng)新生SD大鼠成骨細(xì)胞增殖及成骨活性的影響，為地黃防治骨質(zhì)疏松癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 體外培養(yǎng)原代新生24 h SD大鼠成骨細(xì)胞，細(xì)胞傳至第5代，分別加入1×10-3，1×10-5，1×10-7，1×10-9mol/L梓醇溶液及生理鹽水10 μL/孔， 繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h后，分別檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖情況、骨鈣素(BGP)及堿性磷酸酶(ALP)活性。結(jié)果 培養(yǎng)24 h時(shí)，1×10-3mol/L梓醇溶液能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖(P<0.05)；培養(yǎng)48 h時(shí)，1×10-3mol/L梓醇溶液促增殖作用最強(qiáng)(P<0.05)。培養(yǎng)48 h時(shí)，1×10-7mol/L組和1×10-3mol/L組ALP活性顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)；培養(yǎng)72 h時(shí)，1×10-3mol/L組ALP活性顯著增加(P<0.05)。培養(yǎng)48，72 h后，各濃度梓醇溶液組BGP活性均高于對(duì)照組(P均<0.05)，且1×10-3mol/L組明顯高于其他濃度組(P均<0.05)。結(jié)論 梓醇在1×10-5mol/L和1×10-3mol/L范圍對(duì)體外培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞的增殖、分化及成骨作用相對(duì)顯著，尤其在1×10-3mol/L濃度下作用最顯著，且具有時(shí)效及量效關(guān)系。

骨質(zhì)疏松；地黃；梓醇；成骨細(xì)胞；增殖；分化；堿性磷酸酶；骨鈣素

梓醇(Catalpol)是從玄參科植物地黃中分離的小分子環(huán)烯醚萜類化合物，極性結(jié)構(gòu)，易溶于水，分子式C15H22O10。梓醇是地黃中有效活性成分之一，且含量最多，為具有“滋陰”功效的主要活性成分。研究表明梓醇具有利尿、緩瀉、降血糖、保肝及抗衰老等多種藥理活性[1-2],可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤疾病、糖尿病等多種疾病的防治。目前研究發(fā)現(xiàn)以地黃為主組成的補(bǔ)腎方藥具有明顯的抗骨質(zhì)疏松作用[3-4]，但相關(guān)的基礎(chǔ)研究尚缺乏系統(tǒng)性。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以成骨細(xì)胞增殖、骨鈣素(BGP)活性及堿性磷酸酶(ALP)活性為指標(biāo)，觀察了地黃梓醇對(duì)體外培養(yǎng)新生SD大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化的影響，從而評(píng)價(jià)地黃梓醇在骨代謝過(guò)程中對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)作用。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24 h內(nèi)的SD系乳大鼠， 購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格號(hào):903124。

1.2 試劑和藥品 梓醇(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110808-200407)，胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：27250018)，DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen Corporation公司，批號(hào):1280334),胎牛血清(FBS，中美合資蘭州民海生物工程有限公司,批號(hào):20060402),Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):17101-015),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Sigma公司),堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所),骨鈣素放射免疫分析藥盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司),二甲基亞砜(DMSO,美國(guó)Sigma公司)。

1.3 儀器 COIC XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司),318MC型雙波光酶標(biāo)儀(上海三科儀器有限公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(MRX-Ⅱ型，美國(guó)Dynex公司)，超凈化工作臺(tái)(北京冠鵬凈化設(shè)備有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(Serical No:20201356,日本三陽(yáng)生物電子有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 梓醇用DMEM培養(yǎng)液稀釋成1×10-3，1×10-5，1×10-7，1×10-9mol/L 4個(gè)濃度組，另設(shè)生理鹽水對(duì)照組，每個(gè)藥物濃度均設(shè)6個(gè)平行孔。

1.5 原代成骨細(xì)胞的培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)SD乳大鼠，70%乙醇浸泡10～15 min，無(wú)菌條件下取出乳鼠的顱蓋骨，置于D-hanks液內(nèi)，清洗數(shù)次，清除骨膜、血管等結(jié)締組織；將上液清洗過(guò)的骨片移入0.25%胰蛋白酶消化液中，37 ℃下預(yù)消化15 min，以去除纖維組織，然后將0.25%胰蛋白酶消化液棄掉，移入5 mL含有0.1%Ⅱ型膠原酶的消化液，37 ℃下消化40 min，用眼科剪將骨片剪成大小1～2 mm3的骨粒；棄去0.1%Ⅱ型膠原酶溶液，加入D-hanks液，清洗2～3次。將骨粒分散于100 mL培養(yǎng)瓶中，加入20% FBS的DMEM培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶輕放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基3 d后換液1次，5 d后棄骨粒，細(xì)胞開(kāi)始傳代培養(yǎng)。

1.6 成骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞傳至第5代，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后,用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成4×107L-1的細(xì)胞懸液。以每孔0.2 mL加入96孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞70%融合時(shí)，將含血清培養(yǎng)基吸棄，平衡鹽溶液沖洗2次，更換新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)分別加入1×10-3，1×10-5，1×10-7，1×10-9mol/L梓醇溶液及生理鹽水10 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入MTT 20 μL，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定OD值。

1.7 ALP的測(cè)定 試驗(yàn)方法及藥物和濃度同1.6，繼續(xù)培養(yǎng)48 h、72 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入0.25 mL 0.1%Triton溶液，吹打細(xì)胞，10 min后收集每孔溶液，用于ALP的測(cè)定。ALP測(cè)定采用對(duì)硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動(dòng)力學(xué)法(PNPP)。

1.8 BGP的測(cè)定 試驗(yàn)方法及藥物和濃度同1.6，以每孔0.5 mL接種在24孔培養(yǎng)板中。試驗(yàn)方法及藥物和濃度同上，培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，分別將2塊24孔板取出，吸取培養(yǎng)基，采用放免法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行BGP測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1不同培養(yǎng)時(shí)間各組成骨細(xì)胞增殖情況 培養(yǎng)24h時(shí)，1×10-3mol/L梓醇溶液能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖(P<0.05);培養(yǎng)48h時(shí)，1×10-3mol/L梓醇溶液促增殖作用最強(qiáng)，有效濃度為1×10-5～1×10-3mol/L(P<0.05)；培養(yǎng)72h時(shí)，不同濃度的梓醇溶液促進(jìn)細(xì)胞增殖作用均減弱，各濃度組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05 )。見(jiàn)圖1。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間各組成骨細(xì)胞增殖情況

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間各組ALP活性比較 培養(yǎng)48h時(shí)，1×10-7mol/L組和1×10-3mol/L組ALP活性明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，且1×10-3mol/L組ALP活性明顯高于1×10-7mol/L組(P<0.05)；培養(yǎng)72h時(shí)，1×10-3mol/L組ALP活性顯著高于其他組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間各組BGP活性比較 培養(yǎng)24h時(shí)，各組BGP活性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；培養(yǎng)48h時(shí)，1×10-5mol/L組和1×10-3mol/L組BGP活性顯著高于其他組(P均<0.05)；培養(yǎng)72h時(shí)，各濃度組BGP活性均高于對(duì)照組，1×10-3mol/L組明顯高于其他組(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討 論

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間各組ALP活性比較

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間各組BGP活性比較

在世界范圍內(nèi)，骨質(zhì)疏松癥已是一個(gè)越來(lái)越引起人們重視的健康問(wèn)題，給患者生活帶來(lái)極大的痛苦和不便，已成為老年人生活質(zhì)量下降甚至死亡的主要原因。骨質(zhì)疏松癥是指單位體積骨量減少伴有骨強(qiáng)度的降低，主要與骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)有關(guān)，該過(guò)程由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞來(lái)完成。成骨細(xì)胞是骨代謝過(guò)程中的主要功能細(xì)胞，在骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化的骨代謝過(guò)程中有極其重要的作用[5-6]。成骨細(xì)胞數(shù)量不足或功能減退都會(huì)影響骨的修復(fù)過(guò)程，并可能引發(fā)骨質(zhì)疏松癥，提高成骨細(xì)胞的增殖和分化水平是防治骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵。

地黃為玄參科植物地黃的新鮮或干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，味甘、苦，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有滋陰補(bǔ)腎、養(yǎng)陰生津的功效。梓醇屬環(huán)烯醚萜苷類化合物，是從地黃中分離的單一化學(xué)成分， 2010版《中國(guó)藥典》明確規(guī)定梓醇作為地黃質(zhì)量控制的指標(biāo)[1]。本研究結(jié)果顯示各濃度梓醇溶液對(duì)成骨細(xì)胞增殖均具有促進(jìn)作用，培養(yǎng)24h時(shí)，10-3mol/L梓醇溶液能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖；培養(yǎng)48h時(shí)，10-3mol/L梓醇溶液促增殖作用最強(qiáng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度的梓醇溶液促進(jìn)細(xì)胞增殖作用均減弱，提示梓醇溶液對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用具有時(shí)效性。

ALP是成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志，由成骨細(xì)胞分泌，它既可作為成骨細(xì)胞的功能標(biāo)記物，又可反映其分化成熟程度[7]。本實(shí)驗(yàn)提示，培養(yǎng)48h時(shí)，1×10-7mol/L組和1×10-3mol/L組ALP活性明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，且1×10-3mol/L組ALP活性明顯高于1×10-7mol/L組(P<0.05)；培養(yǎng)72h時(shí)，1×10-3mol/L組ALP活性顯著高于其他

組(P均<0.05)。提示高濃度梓醇溶液能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，具有量效關(guān)系。

BGP又稱骨γ羧基谷氨酸蛋白，是由成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白，是構(gòu)成骨基質(zhì)的成分之一，其功能是保證骨的正常礦化速率。BGP與ALP高度相關(guān)，BGP被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化成熟最具特征性的標(biāo)志物，反映了成骨細(xì)胞成骨功能[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24h，不同濃度梓醇溶液組BGP活性未見(jiàn)明顯變化，可能與培養(yǎng)時(shí)間短有關(guān)；培養(yǎng)48h時(shí)，1×10-5mol/L和1×10-3mol/L濃度已出現(xiàn)促BGP的活性作用；培養(yǎng)72h后，與對(duì)照組相比，不同濃度梓醇溶液均對(duì)成骨細(xì)胞BGP活性有明顯促進(jìn)作用，尤以 1×10-3mol/L濃度明顯。表明1×10-5mol/L和1×10-3mol/L濃度梓醇溶液對(duì)體外培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞的增殖、分化及成骨作用相對(duì)顯著，尤其在1×10-3mol/L的高濃度下作用最顯著，且具有時(shí)效及量效關(guān)系。

綜上所述，地黃單體成分梓醇可促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖及成骨活性，為補(bǔ)腎中藥防治骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)一步研究提供了參考和探索。

[1] 劉彥飛,趙宇,溫學(xué)森,等. 梓醇的藥效學(xué)及化學(xué)轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)中藥雜志,2007,12(32):1128-1230

[2] 董炤,陳長(zhǎng)勛. 梓醇藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 中成藥,2013,35(5):1047-1051

[3] 賈英民,武密山,李恩. 補(bǔ)腎方劑對(duì)成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)干預(yù)的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,20(31):4035-4037

[4] 武密山,李恩,趙素芝,等. 抗骨松顆粒對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)含量和生物力學(xué)的影響[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志,2008,28(23):2289-2292

[5]IwamotoJ,SatoY,TakedeT,etal.Bonequalityandvitamink2intype2diabetes:Reviewofpreclinicalandclinicalstudies[J].NutrRev,2011,69(3):162-167

[6] 陳述祥,康樂(lè). 中藥促成骨細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制與作用[J]. 中國(guó)組織工程研究,2012,16(7):1299-1302

[7]VerborgtO,GibsonGJ,SchafflerMB.Lossofosteocyteintegrityinassociationwithmicrodamageandboneremodelingafterfatigueinvivo[J].JournalofBoneandMineralResearch,2000,15(1):60-67

[8]GameroP.Biomarkersforosteoporosismanagement:utilityindiagnosis,fractureriskpredictionandtherapymonitoring[J].MolDiagnTher,2008,12(3):157-170

[9]AonumaH,MiyakoshiN,HongoM,etal.Lowserumlevelsofundercarboxylatedosteocalininboneresorption[J].TohpkuJExpMed,2009,218(3):201-205

Study on the effect of Catalpol on osteoblastic activity of primary cultured osteoblast in SD neonatal rats

JIA Yingmin1,2, LI Ruiyu3, WU Mishan4, HUO Ruilou2, LI Bin5

(1.Beijing Military General Hospital, Beijing 100700, China;2.Integrated Traditional and Western Medicine Hospital of Pingxiang, Pingxiang 054500, Hebei, China;3.The Second Affiliated Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei, China;4.Hebei College of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050090, Hebei, China;5.Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Objective It is to observe the effect of Catalpol at different concentrations on proliferation and osteoblast activity of primary cultured osteoblast in neonatal SD rats, thus to provide experimental evidence for the prevention and treatment of osteoporosis. Methods Primary rat neonatal 24 h SD osteoblasts were cultured in In vitro, when the cells spread to the 5th generation, they were added with different concentrations of 1×10-3, 1×10-5, 1×10-7, 1×10-9mol/L catalpol saline solution 10 μL/hole, then the culture continued, in 24 h, 48 h, 72 h after culture the proliferation, ALP activity and activity levels of BGP of osteoblasts were detected. Results When cultured for 24 h time, 1×10-3mol/L Catalpol could promote the proliferation of osteoblasts significantly (P<0.05); For 48 h, the proliferation effect of 1×10-3mol/L Catalpol was the strongest (P<0.05). Compared with the control group when cultured for 48 h, the activity of ALP in 1×10-7mol/L and 1×10-3mol/L was significantly higher(P<0.05), for 72 h in 1×10-3mol/L group, the ALP activity was increased significantly(P<0.05). When cultured for 48 h and 72 h, compared with the control group, the activity of BGP in every Catalpol group was all higher (allP<0.05), especially in 1×10-3mol/L group, the activity was the highest than the other groups (P<0.05). Conclusion Catalpol at the concentration range from 1×10-5mol/L to 1×10-3mol/L had significant effect on the proliferation, differentiation and osteoblast activity of primary cultured osteoblast in vitro in neonatal SD rats, especially the effect at concentration of 1×10-3mol/L was most significant, and there was relationship of time-effect and dose-effect.

osteoporosis; Radix rehmanniae; Catalpol; osteoblasts; proliferation; differentiation; alkaline phosphatase; bone glaprotein

賈英民，男，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事慢性腎臟病與骨代謝的中西醫(yī)結(jié)合臨床、教學(xué)及科研工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.23.005

R-33

A

1008-8849(2015)23-2524-03

2015-01-06