任小旦，張瑩雯，王秀萍，鄭保根

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)高糖條件下系膜細(xì)胞Nrf2表達(dá)及T-SOD、MDA的影響

任小旦，張瑩雯，王秀萍，鄭保根

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

[摘要]目的 研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)高糖條件下大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)核因子相關(guān)因子2(Nrf2)表達(dá)及總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的影響，探討其在糖尿病腎病(DN)治療中的作用機(jī)制。方法 將60只大鼠分為正常組、高糖組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組[7 g/(kg·d)]、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組[3.5 g/(kg·d)]、當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組[1.75 g/(kg·d)]、格列奇特組[(2 mg/kg·d)]，每組10只。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)各組GMCs的Nrf2 mRNA表達(dá)情況，Western blot法檢測(cè)各組GMCs的Nrf2蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)各組GMCs培養(yǎng)上清液的T-SOD活性，應(yīng)用硫代巴比妥酸法檢測(cè)各組GMCs培養(yǎng)上清液的MDA含量。結(jié)果 正常組Nrf2 mRNA和蛋白有一定量的表達(dá)，高糖組和正常組相比Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)均增加，當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組對(duì)高糖條件下系膜細(xì)胞Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)均有明顯上調(diào)作用(P均<0.01)；與正常組相比，高糖組T-SOD活性明顯降低(P<0.01)，MDA含量明顯增多(P<0.01)，而當(dāng)歸補(bǔ)血湯各劑量組能提高T-SOD的活性，抑制高糖條件下MDA的過(guò)多生成，尤其以高劑量組最為明顯(P<0.01)。結(jié)論 當(dāng)歸補(bǔ)血湯能上調(diào)高糖條件下系膜細(xì)胞Nrf2的表達(dá)，提高T-SOD的活性，抑制MDA的過(guò)多生成，從而抵抗高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)系膜細(xì)胞。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯；系膜細(xì)胞；Nrf2；T-SOD；MDA

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN) 是糖尿病(diabetes mellitus,DM)引起的危害性最大的慢性微血管并發(fā)癥，已成為導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。近年研究表明，氧化應(yīng)激在 DN 的病理改變中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。核因子相關(guān)因子2(Nrf2)是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的重要轉(zhuǎn)錄因子[4]，因此在細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在糖尿病及其并發(fā)癥的研究中也成了一個(gè)重要的靶點(diǎn)。超氧化物歧化酶(SOD)的活性反映了細(xì)胞內(nèi)清除氧自由基即抗氧化的能力；丙二醛(MDA)是機(jī)體自由基作用于生物膜多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，MDA的含量可反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,間接反映細(xì)胞受損情況和氧自由基水平。SOD和MDA是衡量機(jī)體氧自由基基礎(chǔ)代謝狀態(tài)的主要指標(biāo)。糖尿病腎病屬于祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“消渴”中“下消”的范疇，臨床治療多采用補(bǔ)氣養(yǎng)陰生血、活血化瘀等中藥治療。當(dāng)歸補(bǔ)血湯由補(bǔ)氣的黃芪和活血的當(dāng)歸組成，具有補(bǔ)氣生血活血功效，正契合DN的病因病機(jī)。腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)是DN的各種致病因子作用的主要靶細(xì)胞，因此本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)血清藥理學(xué)研究，探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)高糖條件下GMCs的Nrf2表達(dá)及T-SOD、MDA的影響，從而為當(dāng)歸補(bǔ)血湯用于治療DN提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料及試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 60只SPF級(jí)SD成年雄性大鼠,體質(zhì)量180～200 g,4～6周齡,由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證號(hào):[SCXK(鄂)2003-0004]。大鼠GMCs株(HBZY-1，購(gòu)自武漢大學(xué)典藏中心)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥材、試劑和儀器 當(dāng)歸補(bǔ)血湯(黃芪∶當(dāng)歸=5∶1，由武漢大學(xué)中南醫(yī)院中藥房提供，用自來(lái)水將中藥浸泡30 min后分煎2次混勻，濃縮至2 kg/L藥液， 冷卻后裝瓶放冰箱備用)； 格列奇特(法國(guó)施維雅藥廠，批號(hào): 2005883)；RPM I 1640培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，Gibco公司；超凈工作臺(tái),蘇州凈化;37 ℃ 5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo Forma公司；紫外分光光度計(jì)，BIO-RAD公司；T-SOD和MDA檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，ASPEN公司；電泳儀，北京六一儀器廠，型號(hào)：DYY-6C；兔抗鼠單克隆Nrf2抗體(一抗)，CST公司，目錄號(hào)#8882S；HRP標(biāo)記的山羊抗兔(二抗)，KPL公司，目錄號(hào)074-1506；Trizol,MRC公司；SYBR GreenⅠ熒光染料,晶賽公司；BIO-RAD CFX Connect熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1含藥血清的制備 60只SPF級(jí)SD成年雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、高糖組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組[7 g/(kg·d)]、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組[3.5 g/(kg·d)]、當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組[1.75 g/(kg·d)]、格列奇特組[2 mg/(kg·d)]，每組10只，每日定時(shí)灌胃，各組藥物按大鼠與人等效劑量折算。正常組、高糖組不給藥，每日灌等量生理鹽水,每日1次,連續(xù)7 d。于末次灌胃2 h后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，離心取血清，56 ℃水浴30 min滅活處理后，經(jīng)0.22 μm孔徑的針頭濾器過(guò)濾除菌，分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 正常組(5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇+20%FBS)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖+20% FBS)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組(10%當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量含藥血清+30 mmol/L葡萄糖+10% FBS)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組(10%當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量含藥血清+30 mmol/L葡萄糖+10%FBS)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組(10%當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量含藥血清+30 mmol/L葡萄糖+10% FBS)、格列齊特組(10%格列齊特含藥血清加30 mmol/L葡萄糖+10% FBS)。

1.2.3腎小球系膜細(xì)胞上清液的收集 取傳代培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞,吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌培養(yǎng)瓶2次,然后加0.25%胰蛋白酶,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中,37 ℃消化數(shù)分鐘后加入含20% FBS 1640液5 mL終止消化,4 ℃、1 000 r/min離心5 min,棄去上清,加入培養(yǎng)液以1×104/孔接種于48孔培養(yǎng)板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞貼壁。后更換無(wú)血清1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步于G0/G1期,吸棄培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液,按1.2.2實(shí)驗(yàn)分組加入各自不同條件培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,終止培養(yǎng),離心2 000 r/min,10 min后取上清,收集培養(yǎng)上清液分裝,-70℃低溫冰箱保存。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)各組GMCs的Nrf2的mRNA表達(dá)量 收集培養(yǎng)72 h的各組細(xì)胞，0.01 mol/L PBS洗各組細(xì)胞,按Trizol說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA后，采用BIO-RAD CFX Connect熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:94 ℃ 2 min后,進(jìn)行40個(gè)循環(huán):94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s(監(jiān)測(cè)熒光信號(hào));反應(yīng)完成后于16 ℃保存。采用β-actin為內(nèi)參。引物和內(nèi)參序列如下：Nrf2上游為5’-TGTCAGCTACTCCCAGGTTG-3’，下游為5’-ATCAGGGGTGGTGAAGACTG-3’；β-actin上游為5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，下游為5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。目的基因擴(kuò)增用Ct值,應(yīng)用ΔΔCT法進(jìn)行定量分析。ΔCT(目的基因)=CT目的基因-CT內(nèi)對(duì)照基因,ΔΔCT=ΔCT目的基因-ΔCT標(biāo)準(zhǔn)值,使用2-ΔΔCT計(jì)算基因表達(dá)情況。

1.2.5Western blot檢測(cè)各組GMCs的Nrf2蛋白表達(dá)量 提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度;配制SDS-PAGE膠，取等量蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜3 h，將膜置于5%的脫脂奶粉中，室溫輕搖封閉1 h，加入兔抗鼠單克隆Nrf2一抗(1∶1 000)，4 ℃輕搖過(guò)夜,TBST漂洗3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，室溫輕搖2 h，TBST漂洗，化學(xué)法發(fā)光，曝光，顯影，定影后獲得相應(yīng)蛋白條帶底片，將膠片進(jìn)行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.2.6各組GMCs上清液T-SOD活性和MDA含量檢測(cè)采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)各組GMCs培養(yǎng)上清液的總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)各組GMCs培養(yǎng)上清液的MDA含量。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，若方差齊，組間比較采用單因素方差分析；若方差不齊，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組GMCs的Nrf2的mRNA表達(dá)情況 Nrf2 mRNA在正常組細(xì)胞中有一定量的表達(dá)，高糖組Nrf2 mRNA表達(dá)量高于正常組(P<0.05)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組、高劑量組及格列齊特組Nrf2 mRNA表達(dá)量均明顯高于高糖組(P均<0.05)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組和格列齊特組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組RMCs的Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2各組GMCs的Nrf2蛋白表達(dá)情況 高糖組細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.01)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組、高劑量組及格列齊特組Nrf2蛋白表達(dá)量明顯高于高糖組(P均<0.01)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組和格列齊特組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2及圖3。

圖2 Wertern blot檢測(cè)各組Nrf2蛋白表達(dá)情況

圖3 各組RMCs的Nrf2的蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.3各組GMCs上清液T-SOD活性 高糖組細(xì)胞上清液T-SOD活性顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯各劑量組及格列齊特組T-SOD活性明顯高于高糖組(P均<0.01)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組和格列齊特組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組RMCs的上清液T-SOD活性

2.4各組GMCs上清液MDA含量 高糖組細(xì)胞上清液MDA的含量顯著高于正常組(P<0.01)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組、高劑量組及格列齊特組MDA含量明顯低于高糖組(P均<0.01)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與格列齊特組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組RMCs的上清液MDA含量

3 討 論

糖尿病是目前對(duì)人類影響最大的代謝性疾病，其并發(fā)癥也很多，其中20%～40%會(huì)發(fā)生DN。DN是糖尿病常見(jiàn)的難治性微血管并發(fā)癥,其中約40%的DN會(huì)進(jìn)展成ESRD[5]。DN早期特征性的病理學(xué)改變有腎小球肥大、增殖，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量積聚,腎小球基底膜增厚，最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)彌漫性纖維化。系膜細(xì)胞是腎小球的固有細(xì)胞，對(duì)維持腎小球結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性有重要作用，同時(shí)為腎小球毛細(xì)血管襻調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過(guò)提供結(jié)構(gòu)保障[6]，在DN的發(fā)病過(guò)程中有重要作用。

氧化應(yīng)激已被公認(rèn)為是DN發(fā)病機(jī)制中十分重要的環(huán)節(jié)。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子,是細(xì)胞抗氧化還原的中樞調(diào)節(jié)者[7]。目前研究證實(shí),腎組織活性氧族(reactive oxygen species,ROS)過(guò)度蓄積是導(dǎo)致糖尿病腎損害的重要原因。有研究表明，高糖可刺激機(jī)體系膜細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS及大量表達(dá)的Nrf2，且兩者的改變相一致，提示正常情況下，Nrf2的表達(dá)與氧化應(yīng)激的程度相平行，以維持機(jī)體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡[8]。正常狀態(tài)下，Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中，在與其抑制蛋白Keapl相互作用后降解、失活。 在機(jī)體受到活性氧或親核物質(zhì)的刺激時(shí)，胞質(zhì)中的Nrf2就會(huì)與Keapl解離，發(fā)生去泛素化，并進(jìn)入細(xì)胞核。在胞核內(nèi)，Nrf2結(jié)合其他的bz-IP蛋白形成異二聚體后，與抗氧化反應(yīng)元件ARE靶向結(jié)合使ARE相關(guān)的抗氧化酶基因的表達(dá)上調(diào)，啟動(dòng)Nrf2下游靶基因包括過(guò)氧化氫酶(CAT)、SOD、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、血紅素加氧酶(HO-1)等表達(dá)[9-11]。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的經(jīng)典方，方中黃芪味甘、溫，具有益氣固表、補(bǔ)氣升陽(yáng)等作用；當(dāng)歸味甘、辛溫，能補(bǔ)血生血，氣輕而辛，又能行血。近年有關(guān)當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腎功能保護(hù)作用的研究有眾多報(bào)道，如魏明剛等[12]、趙紅心等[13]分別從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察中發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)DN有明顯的治療作用。周必發(fā)等[14]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠明顯抑制高糖條件下GMC增殖及其細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的增加,從而發(fā)揮預(yù)防和治療腎小球硬化作用,進(jìn)而延緩DN的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能上調(diào)高糖條件下Nrf2的表達(dá)，無(wú)論是從蛋白層面還是從基因?qū)用嫔暇C實(shí)了這一點(diǎn)，尤其在高劑量組尤為明顯。大量研究表明，Nrf2及其下游通路可以對(duì)抗氧化應(yīng)激導(dǎo)致的腎臟細(xì)胞損傷[8，15-16]，而當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有上調(diào)Nrf2表達(dá)的作用，因而具有抗氧化應(yīng)激的功效。本研究還發(fā)現(xiàn)，高糖條件下各組系膜細(xì)胞經(jīng)當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清干預(yù)后上清中MDA含量均有所下降，而SOD總活性均有所上升，高劑量組尤為明顯，對(duì)MDA的調(diào)節(jié)作用甚至優(yōu)于格列奇特。由于MDA含量是直接反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，而SOD活性是間接反映O2-的產(chǎn)生量，而氧化應(yīng)激本就是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加和/或清除能力降低[17]，因此，這些結(jié)果更進(jìn)一步支持了上述結(jié)論。

綜上所述，經(jīng)典的補(bǔ)氣生血方當(dāng)歸補(bǔ)血湯能上調(diào)高糖條件下系膜細(xì)胞Nrf2的表達(dá)，提高T-SOD的活性，抑制MDA的過(guò)多生成，抵抗高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)系膜細(xì)胞，其上述調(diào)節(jié)作用在某些方面甚至優(yōu)于西藥格列奇特。但當(dāng)歸補(bǔ)血湯上調(diào)Nrf2表達(dá)、提高T-SOD活性、抑制MDA過(guò)多生成的具體信號(hào)傳導(dǎo)通路及其機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

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Effects of Danggui Buxue decoction on glomerular mesangial cell Nrf2 expression and T-SOD, MDA in high glucose condition

REN Xiaodan，ZHANG Yingwen，WANG Xiuping，ZHENG Baogen

(Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 430071，Hubei，China)

Objective It is to observe the effects of Danggui Buxue decoction on glomerular mesangial cell Nrf2 expression and T-SOD activity, MDA content in high glucose condition,and to explore its treatment significance in the process of diabetic nephropathy (DN). Methods Sixty rats were randomly divided into normal group, high glucose group, high, medium and low dose of Danggui Buxue decoction groups [7 g/(kg·d), 3.5 g/(kg·d),1.75 g/(kg·d)respectively], Gliclazide group[2 mg/(kg·d)], each group had 10 rats. RT-PCR was used to detect expression of Nrf2 mRNA and Western blot used to detect expression of Nrf2 protein of GMCs in each group；Xanthine Oxidase assay was used to detect T-SOD activity and Thiobarbituric Acid method was used to detect MDA content in cell supernatant of GMCs in each group. Results Both of Nrf2 mRNA and protein in normal group had a certain amount of expression；Nrf2 mRNA (P<0.05) and protein (P<0.01) were both increased in high glucose group compared with normal group. High-dose group has a significantly upregulation effect on Nrf2 mRNA and protein expression of GMCs in high glucose condition(P<0.01). Compared with the normal group, T-SOD activity of high glucose group was significantly decreased (P<0.01), MDA content was significantly increased (P<0.01)；while SOD activity was improved, MDA production in high glucose condition was inhibited in every Dangui Buxue decoction group, especially in the high dose group (P<0.01). Conclusion Danggui Buxue decoction could upregulate the expression of Nrf2 mRNA and protein，improve SOD activity，inhibit MDA excessive generation of GMCs in high glucose condition, thereby resisting oxidative stress induced by high glucose and protecting mesangial cells.

Dangui Buxue decoction；glomerular mesangial cells；Nrf2；T-SOD；MDA

任小旦，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合內(nèi)分泌。

張瑩雯，E-mail ：hhao3838@sina.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373793)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.26.002

R-33

A

1008-8849(2015)26-2855-04

2015-05-10