何東初，肖靜靜，張 勇，林 慧，丁曉娟，涂 穎

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢430070)

論 著

健脾補(bǔ)腎方對輻射損傷小鼠β-catenin、TCF及PPARγ蛋白表達(dá)的影響

何東初，肖靜靜，張 勇，林 慧，丁曉娟，涂 穎

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢430070)

[摘要]目的 研究健脾補(bǔ)腎方對輻射損傷模型小鼠β-鏈蛋白(β-catenin)、T細(xì)胞因子(TCF)及過氧化酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)蛋白表達(dá)的影響，探討其對造血功能的調(diào)控機(jī)制。方法 采用6.0 Gy X射線照射建立輻射損傷模型小鼠，然后將造模成功小鼠隨機(jī)分為模型組、健脾補(bǔ)腎方小劑量組(100%濃度)、健脾補(bǔ)腎方大劑量組(200%濃度)、阿膠漿組,每組12只。另隨機(jī)選取12只正常小鼠作為正常組。正常組、模型組給予生理鹽水0.2 mL/10 g灌胃，2次/d，其余3組分別用健脾補(bǔ)腎方小劑量、大劑量和阿膠漿混懸液0.2 mL/10 g灌胃，2次/d。9 d后處死小鼠，取血檢測外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，收集骨髓檢測β-catenin、TCF及PPARγ蛋白表達(dá)情況，制作骨髓病理切片觀察骨髓病理改變情況，測定脂肪空泡面積。結(jié)果 模型組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及β-catenin、TCF蛋白表達(dá)量明顯低于正常組(P均<0.05),PPARγ蛋白表達(dá)量及骨髓脂肪空泡面積均明顯高于正常組(P均<0.05)；健脾補(bǔ)腎方小劑量組、健脾補(bǔ)腎方大劑量組、阿膠漿組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及β-catenin、TCF蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，PPARγ蛋白表達(dá)量及骨髓脂肪空泡面積均明顯低于模型組(P均<0.05)，尤以小劑量組明顯。結(jié)論 健脾補(bǔ)腎方可通過增強(qiáng)β-catenin/TCF通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制下游靶基因PPARγ的表達(dá)，從而抑制骨髓脂肪化，促進(jìn)骨髓造血功能的重建。

健脾補(bǔ)腎方；輻射損傷；β-catenin；TCF；PPARγ；動物模型

隨著高科技和現(xiàn)代化工業(yè)的發(fā)展，輻射損傷已成為危害人們健康的重要因素，輻射引起的骨髓抑制嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[1]。目前治療輻射損傷多以直接刺激造血細(xì)胞增殖為靶點(diǎn)，而對改善輻射引起的骨髓微環(huán)境損傷研究較少。骨髓脂肪化是輻射損傷后造血微環(huán)境的主要病理變化，骨髓中脂肪組織影響造血微環(huán)境的正常造血支持功能，直接抑制原始造血細(xì)胞的增殖，從而抑制骨髓造血[2]。而抑制骨髓脂肪細(xì)胞形成，改善輻射后造血微環(huán)境可促進(jìn)造血重建。健脾補(bǔ)腎方(既往稱地甘口服液)是我院治療輻射損傷的經(jīng)驗(yàn)方，前期臨床試驗(yàn)表明該方能提高外周血象，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；前期動物實(shí)驗(yàn)從造血細(xì)胞的增殖、骨髓及脾臟相關(guān)凋亡基因表達(dá)等方面闡述了健脾補(bǔ)腎方對小鼠輻射損傷的保護(hù)作用機(jī)制[3-7]。本研究觀察了健脾補(bǔ)腎方對輻射損傷小鼠骨髓脂肪化及造血功能的影響，旨在探討其可能的分子機(jī)制，為恢復(fù)輻射損傷后造血功能提供新的治療途徑。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取清潔級昆明種小鼠60只，體質(zhì)量(18±22)g，雌雄兼用，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，動物合格證號：42000600004104。

1.2藥物制備 健脾補(bǔ)腎方由熟地黃30 g、炙甘草15 g、當(dāng)歸30 g、黃芪30 g、澤瀉9 g、陳皮10 g組成，由醫(yī)院制劑室制備，經(jīng)水煎、過濾、濃縮后，制成100%(每毫升含生藥1 g)和200%(每毫升含生藥2 g)的藥液，分裝備用。阿膠漿由東阿阿膠提供，批號：20101008。

1.3主要試劑 β-鏈蛋白(β-catenin)、T細(xì)胞因子(TCF)及過氧化酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)抗體購自Santacuz公司；羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗、β-actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL底物液購自Thermo公司；RIPA裂解液購自碧云天公司；PVDF膜購自Millipore公司。DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀購自北京六一公司。

1.4造模及分組 60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選擇12只作為正常組，其余小鼠采用一次性給予直線加速器6.0 Gy X射線全身照射，劑量率為450侖，照射9 d。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為小鼠食欲下降、活動減少、白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降。按隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功小鼠分為模型組、健脾補(bǔ)腎方小劑量組(小劑量組，100%濃度)、健脾補(bǔ)腎方大劑量組(大劑量組，200%濃度)、阿膠漿組。正常組、模型組給予生理鹽水0.2 mL/10 g灌胃，其余3組分別用健脾補(bǔ)腎方小劑量、大劑量和阿膠漿混懸液0.2 mL/10 g灌胃，均2次/d。于灌胃第9天處死小鼠，收集外周血、雙側(cè)股骨、脛骨骨髓進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.5骨髓病理切片制作及HE染色 將小鼠雙側(cè)股骨置于4%的鹽酸甲醛脫鈣固定液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，然后在顯微鏡下觀察骨髓造血組織情況并攝像。骨髓腔內(nèi)脂肪空泡面積比例計(jì)算方法：骨髓切片置于100倍高倍鏡下，每組選取20個骨髓腔視野，采用PAS-8000病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組脂肪空泡面積比例。

1.6β-catenin、TCF及PPARγ蛋白表達(dá)檢測 采用Western蛋白電泳法檢測。脛骨骨髓組織塊稱質(zhì)量，加入RIPA裂解液勻漿組織，移入離心管4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，取上清,分裝于-20 ℃保存；采用Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度；取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液(體積×蛋白質(zhì)濃度)，并加等體積的2×電泳加樣緩沖液,沸水浴中3 min,上樣,電泳(濃縮膠20 mA，分離膠35 mA),電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜,用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)室溫封閉2 h,用稀釋好的一抗4 ℃孵育過夜,用稀釋好的HRP標(biāo)記二抗室溫孵育2 h。使用 HRP 標(biāo)記的抗小鼠GAPDH特異性抗體作為內(nèi)參對照檢測。ECL底物液顯現(xiàn)熒光條帶，X射線膠片曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 正常組、模型組、小劑量組、大劑量組和阿膠漿組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(8.05±0.619)109L-1、(1.70±0.400)109L-1、(6.18±0.692)109L-1、(3.34±0.354)109L-1、(3.29±0.442)109L-1。模型組白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于正常組(P<0.05)，小劑量組、大劑量組、阿膠漿組白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于模型組(P均<0.05)，且小劑量組明顯高于大劑量組和阿膠漿組(P均<0.05)。

2.2各組β-catenin、TCF及PPARγ蛋白表達(dá)情況 模型組β-catenin、TCF蛋白表達(dá)量明顯低于正常組(P均<0.05)，PPARγ蛋白表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.05)。小劑量組、大劑量組、阿膠漿組β-catenin、TCF蛋白表達(dá)量明顯高于模型組(P均<0.05)，PPARγ蛋白表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.05)；小劑量組β-catenin、TCF蛋白表達(dá)量明顯高于大劑量組和阿膠漿組(P均<0.05)，PPARγ蛋白表達(dá)量明顯低于大劑量組和阿膠漿組(P均<0.05)。見表1及圖1。

2.3各組小鼠骨髓脂肪面積比較 正常組、模型組、小劑量組、大劑量組和阿膠漿組骨髓脂肪面積分別為(1.99±0.01)%，(17.72±0.05)%，(10.76±0.05)%，(13.21±0.04)%，(14.19±0.06)%。模型組骨髓脂肪空泡面積明顯多于正常組(P<0.05)。小劑量組、大劑量組、阿膠漿組骨髓脂肪空泡面積明顯少于模型組(P均<0.05)，且小劑量組明顯少于大劑量組和阿膠漿組(P均<0.05)。各組小鼠骨髓病理變化見圖2～6。

3 討 論

機(jī)體正常造血的維持由造血細(xì)胞和骨髓微環(huán)境相互調(diào)控、相互作用。造血微環(huán)境對造血細(xì)胞功能的發(fā)揮起支持作用[8-9]。而脂肪細(xì)胞是骨髓微環(huán)境中負(fù)性調(diào)控造血的主要因子，抑制骨髓脂肪形成能夠促進(jìn)造血功能的重建[10]。

表1 各組β-catenin、TCF及PPARγ蛋白表達(dá)情況

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與小劑量組比較，P<0.05。

圖1 Wertern blot檢測各組小鼠蛋白表達(dá)情況

圖2 正常組小鼠骨髓病理變化(HE染色×100)

圖3 模型組小鼠骨髓病理變化(HE染色×100)

圖4 小劑量組小鼠骨髓病理變化(HE染色×100)

圖5 大劑量組小鼠骨髓病理變化(HE染色×100)

圖6 阿膠漿組小鼠骨髓病理變化(HE染色×100)

β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的核心成員，參與調(diào)解骨髓的成脂分化。當(dāng)沒有Wnt信號時，胞內(nèi)的β-catenin被細(xì)胞質(zhì)中的糖原合成酶激酶3β(GSK3β)磷酸化，進(jìn)而被多功能復(fù)合物降解。有Wnt信號時，胞漿內(nèi)的β-catenin聚積，并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，通過影響核內(nèi)TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮作用[11]。PPARγ是激素核受體超家族成員之一，主要在脂肪細(xì)胞表達(dá)，是誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞特異性基因表達(dá)和調(diào)節(jié)脂肪分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[12]。研究表明，PPARγ是Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控成脂分化的主要因子，受TCF/LEF家族調(diào)控。PPARγ的表達(dá)水平可作為脂肪化進(jìn)程的特異性指標(biāo)[13]。

輻射損傷屬中醫(yī)的“虛勞”“血虛證”等范疇，其治療當(dāng)以“虛則補(bǔ)之”為原則。健脾補(bǔ)腎方采用熟地滋腎養(yǎng)陰，填精益髓；甘草補(bǔ)益脾氣，益氣復(fù)脈；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，益氣和營，使氣血各有所歸；黃芪補(bǔ)脾肺之氣，以益生血之源；澤瀉宣泄腎濁，引藥歸經(jīng)；陳皮理氣健脾，行氣導(dǎo)滯，可防止補(bǔ)益藥之滋膩。諸藥配伍，共奏益氣健脾補(bǔ)腎、滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)腎益髓之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，熟地黃對藥物及輻射所致骨髓抑制的小鼠造血功能恢復(fù)有重要作用，能明顯促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖[14-15]。當(dāng)歸多糖對小鼠造血干細(xì)胞、小鼠與人髓系造血祖細(xì)胞的增殖分化有顯著促進(jìn)作用，特別是外周血細(xì)胞減少和骨髓受到抑制時尤為明顯[16-17]。當(dāng)歸多糖還可調(diào)節(jié)造血微環(huán)境，從而促進(jìn)造血細(xì)胞增殖。黃芪能明顯提高外周血水平,促進(jìn)造血細(xì)胞因子的分泌,刺激造血系統(tǒng)的功能,改善化療和放療引起的骨髓抑制狀態(tài)[18-19]。綜上所述，健脾補(bǔ)腎方具有促進(jìn)造血細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)免疫功能的雙重作用。

本研究通過6.0 Gy X射線輻射建立小鼠骨髓損傷模型，經(jīng)輻射后小鼠出現(xiàn)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)減低、骨髓脂肪化改變，說明6.0 Gy X射線輻射后可以成功造模。用健脾補(bǔ)腎方灌胃干預(yù)后，小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高，表明健脾補(bǔ)腎方對輻射損傷小鼠的造血組織具有一定的保護(hù)作用；骨髓切片發(fā)現(xiàn)健脾補(bǔ)腎方能夠抑制輻射后小鼠骨髓脂肪化，改善造血微環(huán)境；Western-blot檢測結(jié)果顯示，健脾補(bǔ)腎方通過促進(jìn)β-catenin、TCF蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化Wnt信號通路，抑制下游轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的表達(dá)，抑制骨髓脂肪化，促進(jìn)骨髓造血功能的重建，且健脾補(bǔ)腎方小劑量組各指標(biāo)改善情況優(yōu)于大劑量組，可能與健脾補(bǔ)腎方中大劑量熟地黃、甘草滋膩之性阻礙胃腸道吸收有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Kim K,McBride WH. Modifying radiation damage[J]. Current Drug Targets,2010,11(11):1352

[2] Naveiras O,Nardi V,Wenzel PL,et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment[J]. Nature,2009,460(7252):259-263

[3] He D,Xiao J,Zhang Y,et al. Effect of the Jianpi Bushen Prescription on the expression of SHP-1, Wnt3a, and AP-1 proteins in chemically damaged mice[J]. Genet Mol Res,2013,13(2):3201-3208

[4] He D,Xiao J,Zhang Y,et al. Effect of the Jianpi Bushen Prescription on expressions of the Wnt3a and Cyclin D1 genes in radiation-damaged mice[J]. Genet Mol Res,2013,12(4):4137

[5] 何東初,吳江平,陳如泉. 血虛證患者凋亡相關(guān)基因的表達(dá)及中藥的影響[J]. 中醫(yī)雜志,2005,46(9):692-694

[6] 何東初,王曉紅,吳江平,等. 地甘口服液對環(huán)磷酰胺所致小鼠脾組織凋亡及相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志,2004,11(5):395-396

[7] 何東初,王曉紅,何輝,等. 地甘口服液對輻射損傷小鼠細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因的影響[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,2004,23(6):432-434

[8] Sugiyama T,Nagasawa T. Bone marrow niches for hematopoietic s-tem cells and immune cells[J]. Inflamm Allergy Drug Targets,2012,11(3):201

[9] Chitteti BR,Cheng YH,Poteat B,et al. Impact of interactions of cellular components of the bone marrow microenvironment on hematopoietic stem and progenitor cell function[J]. Blood,2010,115(16):3239-3248

[10] Poncin G,Beaulieu A,Humblet C,et al. Characterization of spontaneous bone marrow recovery after sublethal total body irradiation:importance of the osteoblastic/adipocytic balance[J]. PLoS One,2012,7(2):e30818

[11] Oh I. Microenvironmental targeting of Wnt/beta-catenin signals for hematopoietic stem cell regulation[J]. Expert Opin Biol Ther, 2010,10(9):1315-1329

[12] Lee JE,Ge K. Transcriptional and epigenetic regulation of PPARγ expression during adipogenesis[J]. Cell Biosci,2014,4:29

[13] Okamura H,Yoshida K,Teramachi J,et al. Reduction of PP2A Cα stimulates adipogenesis by regulating the Wnt/GSK-3β/β-catenin pathway and PPARγ expression[J]. Biochim Biophys Acta,2014,1843(11):2376-2384

[14] 朱敏，段金廒，唐于平，等. 采用化學(xué)藥物聯(lián)合致小鼠血虛模型評價四物湯及其配伍組成的作用特點(diǎn)[J]. 中國中藥雜志，2011，36(18):2543-2547

[15] 朱妍,徐暢. 熟地黃活性成分藥理作用研究進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2011,7(11):173-175

[16] Chen XP,Xiao XF,Zhang LL,et al. Phytochemical and pharmacological studies on Radix Angelica sinensis[J]. Chin J Nat Med,2013,11(6):577-587

[17] 何曉莉,張雁,吳宏,等. 當(dāng)歸多糖對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)保護(hù)作用的研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué),2013,41(35):3734-3736

[18] Jiang Q,Xiao B,Liu C,et al.Astragalus Polysaccharide has hematopoietic and thrombopoietic activities in an irradiation mouse model[J]. Blood,2013,122(21):4216

[19] 左軍,張文釗,胡曉陽,等. 黃芪現(xiàn)代藥理及臨床研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥信息,2014(1):111-112

Effect of Jianpi Bushen Prescription on expressions of β-catenin, TCF and PPARγ proteins in radiation-damaged mice

HE Dongchu, XIAO Jingjing,ZHANG Yong, LIN Hui, DING Xiaojuan, TU Ying

(Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Region, Wuhan 430070, Hubei, China)

Objective It is to investigated the effect of Jianpi Bushen Prescription (JBP) on the expression of β-catenin, TCF and PPARγ proteins in radiation-damaged mice and explore the regulating mechanism on hematopoietic function. Methods The mouse models of radiation damage were established by 6.0 Gy X-rays radiation exposure for 9 days. Then the successful models of mice were randomly divided into model group, low-dose (100%) JBP group, high-dose (200%) JBP group, compound e-jiao slurry (EJS) group, each group had 12 mice. Another 12 normal mice were selected as normal group. The normal group, model group was given normal saline 0.2 mL/10 g by gavage twice per day, the other three groups were respectively given low-dose JBP, high-dose JBP, EJS 0.2 mL/10 g by gavage twice per day. After 9 days, the mice were killed to get their blood to determine peripheral white blood cells, the expressions of β-catenin, TCF and PPARγ proteins were detected in bone marrow, pathological section of bone narrow was made to observe the changes of pathology, and the proportion of adipocyte area were measured. Results After irradiation, the number of white blood cells decreased obviously, the protein expression of β-catenin, TCF proteins were significantly downregulated, the protein expression of PPARγ protein was significantly upregulated and the percentage of adipocyte area was increased,in the model group compared to the control group (P<0.05). The low dose JBP, high dose JBP, and e-jiao slurry treatments significantly upregulated the protein expression of β-catenin, TCF proteins and downregulated the protein expression of PPARγ protein, the percentage of adipocyte area was reduced compared to the model group (P<0.05), with the low dose JBP producing the best results. Conclusion JBP plays a protective role on bone narrow hematopoietic function through the activation of the β-catenin/TCF signaling pathway, and inhibited adipogenesis by redcucing the expression of PPARγ.

Jianpi Bushen Prescription; radiation-damage; β-catenin；TCF；PPARγ; mice model

何東初，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，從事風(fēng)濕病研究工作。

肖靜靜，E-mail：xjj5220@sina.com

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273905)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.26.001

R-332

A

1008-8849(2015)26-2851-04

2015-01-05