胡少婷，李升錦，黃秦

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400010）

·論著·

髓樣分化因子88抑制劑ST2825對(duì)重組恥垢分枝桿菌感染THP-1細(xì)胞自噬的影響

胡少婷，李升錦，黃秦

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400010）

目的探討髓樣分化因子88抑制劑ST2825對(duì)重組恥垢分枝桿菌感染THP-1細(xì)胞自噬的影響。方法使用髓樣分化因子88抑制劑ST2825作用于重組恥垢分枝桿菌感染的THP-1細(xì)胞，確定ST2825干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組、無ST2825作用的對(duì)照組以及空白組。運(yùn)用熒光顯微鏡觀察自噬小體，RT-PCR檢測(cè)Beclin-1基因和Bcl-2基因的mRNA的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的自噬熒光小點(diǎn)數(shù)目明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Beclin-1和Bcl-2mRNA表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)。結(jié)論髓樣分化因子88抑制劑ST2858可能通過干擾Beclin-1和Bcl-2的分離，抑制THP-1細(xì)胞自噬。

髓樣分化因子88；ST2825；重組恥垢分枝桿菌

自噬是巨噬細(xì)胞執(zhí)行免疫防御的重要手段，巨噬細(xì)胞通過自噬可殺滅入侵的病原微生物，其中包括結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）。在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)，在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，形成自噬體結(jié)構(gòu)。自噬體形成后可與溶酶體融合，并借助于溶酶體酸性環(huán)境降解入侵的MTB，達(dá)到免疫防御的目的。MTB以及其組成成分，可通過Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）識(shí)別后激活機(jī)體免疫反應(yīng)。髓樣分化分子88（myeloid differentiation factor 88，Myd88）是TLRs信號(hào)途徑的重要轉(zhuǎn)載分子，ST2825是Myd88特異性免疫抑制劑，可阻斷TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［1］。本研究通過觀察Myd88抑制劑ST2825對(duì)重組恥垢桿菌感染THP-1細(xì)胞形成自噬小體、自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討Myd88在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬中的作用，為尋求以Myd88為作用點(diǎn)研究新的抗結(jié)核藥物加強(qiáng)宿主巨噬細(xì)胞自噬作用，更有力清除機(jī)體內(nèi)MTB提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

重組恥垢桿菌MS-pMV-eis（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院檢驗(yàn)科保存）、LB培養(yǎng)基（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室）、人單核巨噬細(xì)胞THP-1細(xì)胞（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室）、自噬體熒光表達(dá)質(zhì)粒GFP-LC3質(zhì)粒（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院檢驗(yàn)科保存）、pCDNA3.1-3flag質(zhì)粒（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院檢驗(yàn)科保存），Beclin-1引物和Bcl-2引物（大連寶生物公司）、RNA提取劑（大連寶生物公司）、細(xì)胞培養(yǎng)用1640培養(yǎng)基+胎牛血清（Hyclone）、雷帕霉素（上海生物工程有限公司）、PMA（Sigma公司）、ST2825（美國(guó)MCE公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)：從平板上挑取MS-pMV-eis，接種于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基（燒瓶），在37℃下震蕩培養(yǎng)下培養(yǎng)7 d，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌用RMPI1640培養(yǎng)液重懸浮，調(diào)整濃度為1×105/mL。

1.2.2 THP-1細(xì)胞的制備及培養(yǎng)：采用含有10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，加入PMA培養(yǎng)24 h使細(xì)胞分化為貼壁的巨噬細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，調(diào)整為1×104/mL鋪于6孔板。

1.2.3 重組恥垢分枝桿菌感染細(xì)胞模型的制備：THP-1細(xì)胞標(biāo)本分為3組：實(shí)驗(yàn)組（THP-1細(xì)胞+MS-pMV-eis）、對(duì)照組（THP-1細(xì)胞+MS-pMV-eis）、空白組（THP-1細(xì)胞）。按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10∶1的比例以MS-pMV-eis感染實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的THP-1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 藥物干預(yù)：上述細(xì)胞和細(xì)菌共培養(yǎng)48 h后，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加入濃度為20 μmol/L ST2825，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5 自噬體檢測(cè)：上述各組細(xì)胞將空質(zhì)粒pCDNA3.1-3flag質(zhì)粒（0.4 μg）與GFP-LC3質(zhì)粒（0.4 μg）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染方法按試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染6 h后換液，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞中自噬熒光小點(diǎn)的形成數(shù)目。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)自噬基因Beclin-1和抑制自噬基因Bcl-2的表達(dá)水平：上述各組細(xì)胞收集后運(yùn)用RNA提取試劑提取總RNA。GAPDH及Beclin-1、Bcl-2引物序列由大連寶生物合成，以GAPDH作內(nèi)對(duì)照（表1）。PCR擴(kuò)增條件：94℃5 min；94℃40 s，56℃30 s，72℃32 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液1 μL進(jìn)行瓊脂糖膠電泳，確認(rèn)RT-PCR產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 各基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

2 結(jié)果

2.1 ST2825影響自噬小體表達(dá)情況

熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞均可觀察到自噬熒光小點(diǎn)，但在ST2825作用下，THP-1細(xì)胞中自噬熒光小點(diǎn)數(shù)目明顯減少（7±2），而對(duì)照組細(xì)胞中自噬熒光小點(diǎn)數(shù)目較多（112±3），2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明Myd88在THP-1細(xì)胞的自噬形成過程中起著重要作用（圖1）。

2.2 ST2825影響B(tài)eclin-1和Bcl-2mRNA表達(dá)情況

用RT-PCR在RNA水平上檢測(cè)Beclin-1和Bcl-2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用ST2825處理細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組的Beclin-1和Bcl-2的條帶較對(duì)照組變暗變窄，表示上述基因的表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)，表示Myd88影響其表達(dá)，見圖2。

3 討論

自噬作為胞內(nèi)物質(zhì)降解的通路，在機(jī)體的抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用，尤其在對(duì)抗MTB等胞內(nèi)病原體感染過程中，宿主細(xì)胞可以通過自噬識(shí)別并靶向清除胞內(nèi)菌。近期研究發(fā)現(xiàn)TLRs能夠識(shí)別MTB及其組分，直接啟動(dòng)天然免疫，也可以同時(shí)上調(diào)抗原提呈細(xì)胞表面的主要組織性復(fù)合物Ⅱ分子和共刺激分子的表達(dá)，誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答?，F(xiàn)國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)TLRs可介導(dǎo)自噬，并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌效應(yīng)。Shin等［2］報(bào)導(dǎo)MTB的脂蛋白LpqH與巨噬細(xì)胞表面的TLR2/CD14結(jié)合，可啟動(dòng)AMPK和p38-MAPK信號(hào)途徑，啟動(dòng)抗菌肽，抗菌肽表達(dá)后可誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，形成自噬小體。除TLR3外，其他TLR都完全或部分依賴于Myd88轉(zhuǎn)到信號(hào)，因此Myd88是TLRs途徑的關(guān)鍵分子點(diǎn)。阻斷Myd88依賴性信號(hào)通路，增加宿主感染化膿性細(xì)菌、皰疹病毒的機(jī)會(huì)［3］。

圖1 熒光顯微鏡下觀察各組THP-1細(xì)胞的自噬小體的表達(dá) ×40Fig.1 Counting of autophagosomes of THP-1 cells in different groups under fluorescence microscopy×40

圖2 RT-PCR檢測(cè)各組THP-1細(xì)胞的Beclin-1和Bcl-2基因的mRNA的表達(dá)變化Fig.2 Expression of Beclin-1mRNA and Bcl-2mRNA in THP-1 cells detected by RT-PCR

Myd88在1900年首次認(rèn)為是髓樣分化初級(jí)反應(yīng)的基因，本質(zhì)上是一種胞質(zhì)可溶性蛋白，其結(jié)構(gòu)上有3個(gè)功能區(qū)域：N端死亡區(qū)域（death domain，DD）、中間區(qū)域、C端區(qū)域。它的DD區(qū)類似于IL-1受體的胞質(zhì)區(qū)，通過招募鏈接蛋白傳遞信號(hào)；中間區(qū)域與白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK）作用有關(guān)，在TLR信號(hào)通路中能誘導(dǎo)啟動(dòng)NF-κB、P38、JNK［4，5］。已有實(shí)驗(yàn)證明，myd88基因在抵御及清除卡介苗方面發(fā)揮重要作用。德國(guó)研究者敲除小鼠Myd88基因后，與正常組感染相同數(shù)量的卡介苗5 d后，CT檢查發(fā)現(xiàn)基因敲除組小鼠的肺、肝臟、脾臟均可看到熒光素陽性區(qū)域，而正常組未發(fā)現(xiàn)［6］。有學(xué)者［1］發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Myd88基因的外顯子1和2部分，其鼠感染卡介苗后不能清除卡介苗，表示該小鼠清除卡介苗的能力被破壞［7］。

本實(shí)驗(yàn)以設(shè)計(jì)ST2825干預(yù)重組恥垢分枝桿菌感染THP-1細(xì)胞的模型，觀察Myd88特異性抑制劑ST2825對(duì)THP-1細(xì)胞自噬的影響，試圖為研究以Myd88為作用點(diǎn)的藥物調(diào)節(jié)自噬，增強(qiáng)機(jī)體抗結(jié)核效應(yīng)提供依據(jù)。既往Loiarro等［1］已經(jīng)證明ST2825是以Myd88 TIR域BB環(huán)七肽為模板進(jìn)行合成的，能特異性抑制Myd88的TIR區(qū)域的同源二聚化作用及下游信號(hào)分子IL-1受體相關(guān)激酶4（interleukin-1 receptor assiociated kinase4，IRAK4）、IRAK1活性，進(jìn)而不能激活NF-κB、P38和JNK信號(hào)途徑。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組恥垢桿菌感染的THP-1細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到大量的自噬小體，而加入ST2825干預(yù)后，自噬小體數(shù)量明顯減少。同時(shí)運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin-1和抑制自噬基因Bcl-2的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組兩基因的mRNA表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)明顯。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示ST2825可抑制自噬的形成，并干預(yù)Beclin-1基因和Bcl-2基因的表達(dá)。本研究結(jié)果說明Myd88可調(diào)節(jié)THP-1細(xì)胞自噬形成及相關(guān)基因的表達(dá)。之前Shi等［8］將shRNAs沉默Myd88基因，用LPS刺激該基因沉默的RAW264.7細(xì)胞，在電子顯微鏡下觀察到正常組的自噬小體數(shù)目明顯高于基因沉默組，與本研究結(jié)論相一致。Bcl-2作為抗凋亡蛋白，在正常情況下與Beclin-1持續(xù)結(jié)合，抑制自噬，而進(jìn)一步運(yùn)用免疫共沉淀方法發(fā)現(xiàn)Myd88可干預(yù)Beclin-1和Bcl-2的分離，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［8］。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Myd88抑制劑ST2825可導(dǎo)致THP-1細(xì)胞的Beclin-1基因和Bcl-2基因的表達(dá)下調(diào)，證實(shí)了Shi等［8］的研究觀點(diǎn)。故我們推測(cè)ST2825通過干擾Beclin-1和Bcl-2的分離抑制自噬。

［1］Loiarro M，Capolunghi F，F(xiàn)antò N，et al.Pivotal advance：Inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAK1 and IRAK4 by a novel peptidomimetic compound［J］.Leuko Biol，2007，82（4）：801-810.

［2］Shin DM，Yuk JM，Lee HM，et al.Mycobacterial lipoprotein activates autophagy via TLR2/1/CD14 and a functional vitamin D receptor signaling［J］.Cell Microbiol，2010，12（11）：1648-1665.

［3］Netea MG，Wijmenga C，O'Neill LA.Genetic variation in Toll-like receptors and disease susceptibility［J］.Nat Immunol，2012，13（6）：535-542.

［4］吳燕燕，王易.Toll樣受體信號(hào)通路中MyD88的研究進(jìn)展［J］.免疫學(xué)，2012，28（3）：262-265.

［5］Warner N，Nú?ez G.MyD88：A critical adaptor protein in innate immunity signal transduction［J］.J Immunol，2013，190（1）：3-4.

［6］Berod L，Stüve P，Swallow M，et al.MyD88 signalling inmyeloid cells is sufficient toprevent chronic mycobacterial infection［J］.Eur J Immunol，2014，44（5）：1399-1409.

［7］Gais P，Reim D，Jusek G，et al.Cutting edge：divergent cell-specific functions of MyD88 for inflammatory responses and organ injury in septic peritonitis［J］.Immunology，2012，188（12）：5833-5837.

［8］Shi CS，Kehrl JH.MyD88 and trif target Beclin 1 to trigge autophagy in macrophages［J］.Biol Chem，2008，283（48）：33175-33182.

（編輯武玉欣）

The Effect of Myeloid Differentiation Factor 88 Inhibitor ST2825 on the Autophagy of THP-1 Cells Infected with Recombinant Mycobacterium smegmatis

HU Shao-ting，LI Sheng-jin，HUANG Qin

（Department of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China）

Objective To investigate the effect of myeloid differentiation factor88 inhibitor ST2825 on the autophagy of THP-1 cells infected by recombinant mycobacterium smegmatis.MethodsThe myeloid differentiation factor 88 inhibitor ST2825 was applied on the THP-1 cells infected by recombinant mycobacterium smegmatis，and three groups were defined：the test group with ST2825 treatment，the control group without ST2825 treatment，and the blank group.Autophagosomes were observed under the fluorescence microscope，and the mRNA expression of Beclin-1gene and Bcl-2gene was analyzed by RT-PCR.ResultsCompared with the control group，the number of autophagy fluorescent dots in the test group was obviously reduced（P＜0.05），and the expression levels of Beclin 1 gene and Bcl-2 gene were declined as indicated by the RT-PCR detection.ConclusionThe myeloid differentiation factor 88 inhibitor ST2825 might inhibit the autophagy of THP-1 cells through interfering the separation of Beclin-1 and Bcl-2.

myeloid differentiation factor 88；ST2825；recombinant mycobacterium smegmatis

R372

A

0258-4646（2015）06-0562-04

胡少婷（1989-），女，碩士研究生.

李升錦，E-mail：lsj1025@163.com

2015-01-03

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：