周洋，周佳任，徐漫飛，張怡舜，趙巖

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

·論著·

未足月胎膜早破患者外周血中分泌型磷脂酶A2的表達(dá)與羊膜腔感染的相關(guān)性

周洋，周佳任，徐漫飛，張怡舜，趙巖

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

目的研究外周血中分泌型磷脂酶A2（sPLA2）在未足月胎膜早破及羊膜腔感染中的作用及其意義。方法采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測30例未足月胎膜早破患者（實驗組）分娩發(fā)動前后、30例未發(fā)生胎膜早破的未足月正常妊娠患者（正常對照組）及30例足月胎膜早破患者（足月對照組）分娩發(fā)動后外周血中sPLA2mRNA的表達(dá)水平。未足月胎膜早破患者結(jié)束妊娠后取胎膜行病理學(xué)檢查，以確定有無組織學(xué)絨毛膜羊膜炎。結(jié)果未分娩發(fā)動時sPLA2mRNA的表達(dá)水平實驗組為1.079± 0.746，正常對照組為0.651±0.481，實驗組與同孕周正常對照組相比sPLA2mRNA的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.011）。分娩發(fā)動時外周血中sPLA2mRNA的表達(dá)水平實驗組為2.439±0.086，足月對照組為2.575±0.036，實驗組與足月對照組相比sPLA2 mRNA的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.787）。實驗組中分娩發(fā)動時sPLA2的含量與是否患絨毛膜羊膜炎有關(guān)（P=0.008）。結(jié)論sPLA2升高可能參與未足月胎膜早破的發(fā)病，并與羊膜腔的感染有關(guān)。

胎膜早破；分泌型磷脂酶A2；絨毛膜羊膜炎；分娩發(fā)動

分娩的發(fā)動是一個極其復(fù)雜的生理過程，是受多種因素綜合作用的結(jié)果。目前國內(nèi)外有很多證據(jù)支持前列腺素在促進子宮收縮及啟動人類分娩方面起著核心作用［1］，分泌型磷脂酶A2（secretoryphospholipase A2，sPLA2）作為前列腺合成途徑中其中一步的限速酶，被證實在人類妊娠組織中表達(dá)。國內(nèi)現(xiàn)有研究表明早產(chǎn)及足月臨產(chǎn)組血清中sPLA2含量均高于對照組，這些結(jié)果提示未足月或足月分娩發(fā)動時sPLA2表達(dá)上調(diào)可能是導(dǎo)致前列腺素合成增加的部分原因，并且sPLA2的表達(dá)增加可能與自發(fā)性胎膜早破有關(guān)［2］，但尚缺少相關(guān)研究及有力證據(jù)。最近的國外研究表明，使用反義寡核苷酸抑制sPLA2的表達(dá)及酶活性可以抑制前列腺素合成［3］，這為降低早產(chǎn)的發(fā)生率提供了新的治療技術(shù)干預(yù)，為預(yù)防早產(chǎn)的發(fā)生提供了新方向。胎膜早破是導(dǎo)致早產(chǎn)的重要原因之一，其中未足月胎膜早破（孕周小于37周的胎膜早破）對于新生兒圍產(chǎn)期患病率及死亡率的影響最大，而發(fā)生胎膜早破后是否出現(xiàn)羊膜腔感染對于新生兒及孕婦的預(yù)后均具有重要意義。國內(nèi)現(xiàn)有關(guān)sPLA2與未足月胎膜早破及宮內(nèi)感染相關(guān)性的研究較少。因此，本研究通過檢測未足月胎膜早破患者外周血中sPLA2 mRNA的水平，探討其在未足月胎膜早破中的表達(dá)及意義，評價高水平sPLA2對診斷未足月胎膜早破后宮內(nèi)感染的可行性以及其能否作為預(yù)測宮內(nèi)感染的指標(biāo)，探討未足月胎膜早破分娩發(fā)動的可能機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2014年2月至11月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科住院的患者共90例，將30例未足月胎膜早破患者（孕28～36周）編入實驗組，將與實驗組同期入院的30例未發(fā)生胎膜早破的孕28～36周的正常妊娠患者作為正常對照組（與實驗組比較孕周無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05），將30例足月胎膜早破患者（孕37～40周）作為足月對照組。采每位受試對象抗凝外周血5 mL，分離血清。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有高血壓、心臟病、肝炎、腎炎、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病等合并癥；本次為多胎妊娠、妊娠有先兆流產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病、糖尿病等產(chǎn)科并發(fā)癥及有臨床感染癥狀（包括孕婦體溫高于37.5℃、母體外周血白細(xì)胞≥15×109/L、胎心率＞l60次/min等）。

1.2 儀器設(shè)備和試劑

-70℃深低溫冰箱（日本SANYO公司）；實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；引物合成由上海Invitrogen公司完成；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR工具包（日本Takara公司）；TrizolTMRNA隔離試劑（美國Invitrogen公司）。

1.3 實驗方法

sPLA2 mRNA的含量使用實時定量PCR法測定，具體步驟如下：（1）-80℃冰箱內(nèi)取出凍存外周血，加入氯仿、異丙醇，沉淀并純化RNA，取RNA溶液2 μL，采用紫外分光光度計檢測樣本的光密度（optical density，OD）值和濃度，A260/A280均在1.8～2.0之間。（2）DNA消化酶Ⅰ處理RNA，去除基因組污染。配制反應(yīng)液，37℃孵育60 min即得到無DNA的RNA溶液。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，配制反應(yīng)液，37℃反應(yīng)15 min，4℃反應(yīng)5 s，以此cDNA為模板進行實時定量PCR或長期保存于-70℃。（3）引物序列：GAPDH正義鏈5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′，反義鏈5′-GGTCATTGATGGCAACAA-3′，引物長度18 bp。（4）配制實時PCR反應(yīng)體系，在PCR儀上擴增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min、94℃變性5 s、60℃退火30 s，共40個循環(huán)。（5）△△Ct法分析結(jié)果：采用相對定量的方法，以GAPDH基因mRNA的表達(dá)為內(nèi)參基因，依據(jù)公式△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，分別計算實驗組和對照組的△Ct，再依公式△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組，計算出△△Ct值，最后計算相對表達(dá)量的差值即2-△△Ct，它表示的是實驗組目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)。

在實驗組患者結(jié)束妊娠后取胎膜行病理學(xué)檢查。組織學(xué)羊膜腔感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)：采用HE染色法，絨毛膜板及羊膜上白細(xì)胞呈彌散性聚集，每個高倍鏡視野有5～10個中性粒細(xì)胞浸潤，且白細(xì)胞浸潤呈極性分布。確定有無組織學(xué)絨毛膜羊膜炎（histological chorioamnionitis，HCA）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗組和對照組間各計量資料的比較進行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組與正常對照組外周血中sPLA2 mRNA的表達(dá)

實驗組在未分娩發(fā)動時與正常對照組患者入院時外周血中sPLA2 mRNA含量分別為1.079± 0.746和0.651±0.481。實驗組外周血中sPLA2 mRNA含量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.011）。

2.2 實驗組分娩發(fā)動時HCA患者與非HCA患者sPLA2mRNA的表達(dá)

入院時HCA患者與非HCA患者比較sPLA2 mRNA水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.480）。而分娩發(fā)動時，HCA患者sPLA2 mRNA水平高于非HCA患者（P=0.008），分娩發(fā)動時間HCA患者短于非HCA患者（P=0.020），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.3 實驗組與足月對照組分娩發(fā)動時sPLA2 mRNA的表達(dá)

實驗組分娩發(fā)動時sPLA2 mRNA的含量（2.439±0.086）與足月對照組（2.575±0.036）比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.787），提示胎膜早破患者分娩發(fā)動時sPLA2表達(dá)隨著妊娠周數(shù)增加無明顯差異。

表1 HCA患者與非HCA患者間比較Tab.1 Comparison between HCA and non-HCA patients

3 討論

3.1 關(guān)于sPLA2在未足月胎膜早破發(fā)生中的作用

磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一種重要的調(diào)節(jié)和代謝酶類，廣泛存在于哺乳動物的細(xì)胞和體液之中，在體內(nèi)發(fā)揮多種生理功能，如膜磷脂的降解和代謝、信號傳導(dǎo)、宿主防御、血液凝固、細(xì)胞膜重建、二十二烷酸前體生成等。

近年來，各醫(yī)學(xué)學(xué)科中sPLA2的作用主要集中在幾個方面：（1）腫瘤病變、細(xì)胞增殖、血管侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面［7］；（2）與男性生殖相關(guān)，如精子獲能、頂體反應(yīng)及受精過程中［8］；（3）與動脈粥樣硬化相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)它們可以進而促進巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的泡沫化，促進膠原蛋白的暴露，從而導(dǎo)致動脈粥樣斑塊的形成和發(fā)展［9］。

PLA2可分為分泌型（sPLA2）、胞漿型（cPLA2）、非鈣離子依賴型（iPLA2）3種類型［4，5］。近年來有研究表明：sPLA2與cPLA2均被證實在人類妊娠組織中有表達(dá)，而且分娩發(fā)動時表達(dá)上調(diào)的是sPLA2［6］，妊娠期sPLA2主要表達(dá)在羊膜、絨毛膜、蛻膜或胎盤。

很多證據(jù)支持前列腺素在子宮收縮和啟動人類分娩機制方面起著重要作用，前列腺素合成大致分為3個階段，首先由磷脂酶催化膜磷脂生成花生四烯酸，接著由環(huán)氧合酶催化花生四烯酸生成前列腺素H2，最后各種特異性前列腺素合成酶催化生成前列腺素E、前列腺素F、前列環(huán)素和血栓素?？梢娗傲邢偎氐暮铣芍?，sPLA2是一步極其重要的限速酶。這些結(jié)果提示早產(chǎn)或足月產(chǎn)時sPLA2表達(dá)上調(diào)可能是前列腺素合成增加的部分原因［2］。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，實驗組在未分娩發(fā)動時sPLA2水平即明顯高于正常對照組，而實驗組中HCA與非HCA患者入院時sPLA2水平無統(tǒng)計學(xué)差異，表明入院sPLA2高水平來自于胎膜早破，而不是宮內(nèi)感染。在國內(nèi)，有關(guān)sPLA2與早產(chǎn)關(guān)系的研究較少，現(xiàn)有研究表明早產(chǎn)臨產(chǎn)及足月臨產(chǎn)組血清磷脂酶A2含量均高于對照組。與研究發(fā)現(xiàn)的sPLA2在早產(chǎn)婦女的子宮下段肌層中表達(dá)顯著升高相符，所以作為重要分娩啟動機制的限速酶之一，sPLA2含量的測定可能對早產(chǎn)的預(yù)測非常有用［3］。

胎膜早破被認(rèn)為是發(fā)動早產(chǎn)最可能的原因，隨著人們對未足月胎膜早破發(fā)病機制的不斷研究，現(xiàn)胎膜早破的發(fā)病機制研究已從單純的機械力學(xué)到感染、從細(xì)胞因子到基因水平，其中亞臨床宮內(nèi)感染被認(rèn)為是胎膜早破發(fā)病的主要原因，且與胎膜早破互為因果。胎膜早破多與感染及炎癥有關(guān)，感染時胎膜局部張力下降，炎癥時細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、腫瘤壞死因子α升高，可激活溶酶體酶，破壞羊膜組織導(dǎo)致胎膜早破［10］。

本研究表明，未足月胎膜早破患者外周血中sPLA2較同孕周正常妊娠患者升高（P＜0.05），提示胎膜早破的發(fā)生可能與sPLA2含量的增高有一定關(guān)系。sPLA2含量升高，使IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、腫瘤壞死因子α、γ干擾素等炎性因子分泌增加，引起一系列炎性反應(yīng)，導(dǎo)致胎膜膠原加速降解，胎膜強度及韌性均有所下降，進而導(dǎo)致胎膜破裂。最近的國外研究表明：使用反義寡核苷酸抑制sPLA2的表達(dá)及酶活性可以抑制前列腺素合成［3］，這對降低早產(chǎn)的發(fā)生率提供了新的治療技術(shù)干預(yù)，對預(yù)防早產(chǎn)的發(fā)生提供了新方向。

3.2 未足月胎膜早破與羊膜腔內(nèi)感染

早產(chǎn)是圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)中的一個重要、復(fù)雜而又常見的妊娠并發(fā)癥。目前，早期嬰兒的死亡率中75%與早產(chǎn)有關(guān)，死于新生兒期者15%為早產(chǎn)兒，尚有8%的早產(chǎn)兒雖然存活，但可遺留下智力障礙或神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)后遺癥［11］。其中未足月胎膜早破是造成極低及超低出生體質(zhì)量兒的常見產(chǎn)科因素，并對新生兒圍產(chǎn)期總死亡率的升高貢獻達(dá)到了近20%［12］。所以，發(fā)生未足月胎膜早破后延長孕周，從而增加胎兒的成熟度，減少死亡率，同時避免宮內(nèi)感染成為了產(chǎn)科醫(yī)生保守治療的目標(biāo)，同時也是臨床工作中遇到的一大挑戰(zhàn)。一旦發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染，則應(yīng)該盡快終止妊娠，減少新生兒感染等不良后果發(fā)生的可能性。但目前臨床上尚無一種令人滿意的實驗室檢查可以在早期發(fā)現(xiàn)或診斷宮內(nèi)感染。目前臨床上常用的生物指標(biāo)包括紅細(xì)胞沉降率、白細(xì)胞計數(shù)及C反應(yīng)蛋白測定等。其中，臨床上最常用的是外周血白細(xì)胞計數(shù)及C反應(yīng)蛋白水平。

白細(xì)胞計數(shù)升高是嚴(yán)重的全身性感染的臨床金標(biāo)準(zhǔn)，但其為非特異性，通常白細(xì)胞計數(shù)≥15× 109/L可早期輔助診斷HCA，但其在宮內(nèi)感染早期診斷中的意義不大［13，14］。

C反應(yīng)蛋白是一種隨著急性炎癥出現(xiàn)而升高的急性期反應(yīng)蛋白。結(jié)合C反應(yīng)蛋白隨時間的增長速度，可明顯增加其診斷細(xì)菌感染的精確性，所以作為一種標(biāo)記物，C反應(yīng)蛋白被廣泛用于感染、炎癥及惡性腫瘤的診斷。目前在產(chǎn)科臨床上，C反應(yīng)蛋白經(jīng)常被用作無明顯癥狀的宮內(nèi)感染的診斷以及未足月胎膜早破后保胎過程中的宮內(nèi)感染監(jiān)測指標(biāo)。當(dāng)C反應(yīng)蛋白≥2 mg/dL，或入院后每天濃度變異≥30%，則可協(xié)助HCA的診斷；C反應(yīng)蛋白在臨界值，其百分變異系數(shù)＞15%（相隔6 h連續(xù)測定）應(yīng)懷疑HCA感染。

由此可見，在實驗組分娩發(fā)動時與未伴隨HCA的實驗對象比較，伴隨HCA的實驗對象sPLA2表達(dá)升高，這提示了sPLA2的表達(dá)高低與HCA的發(fā)生具有一定關(guān)系。sPLA2的高表達(dá)可能在一定程度上啟動相關(guān)炎性反應(yīng)的發(fā)生，進而從某一方面促成HCA的發(fā)生。另一方面，本實驗中sPLA2高表達(dá)者發(fā)動產(chǎn)程的時間明顯縮短（P=0.02），進一步說明sPLA2可能是加速分娩進程的重要因素之一。

3.3 sPLA2與妊娠周數(shù)的關(guān)系

本研究中，在實驗組及足月對照組分娩發(fā)動時，比較sPLA2的表達(dá)無明顯差異（P=0.787），這一結(jié)果的產(chǎn)生可能是因為本實驗入選實驗組及對照組的觀察例數(shù)較少，存在一定偏差。如擴大實驗的范圍或例數(shù)，也許能得出不一樣的結(jié)論。就本研究而言，胎膜早破分娩發(fā)動時sPLA2的表達(dá)高低與妊娠周數(shù)無明顯關(guān)系。

綜上所述，sPLA2的升高可能參與未足月胎膜早破的發(fā)病，同時其表達(dá)的高低從某種程度上促成了組織學(xué)HCA的發(fā)生。如對其深入研究，將有助于進一步闡明胎膜早破的發(fā)生機制，為預(yù)防胎膜早破、羊膜腔感染及早產(chǎn)提供新思路，為減少新生兒感染等不良后果的發(fā)生開辟新途徑。

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（編輯陳姜）

Correlation of Expression of Secretory Phospholipase A2 in Peripheral Blood and Infection of Amniotic Cavity in Preterm Premature Rupture of Membranes

ZHOU Yang，ZHOU Jia-ren，XU Man-fei，ZHANG Yi-shun，ZHAO Yan

（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To explore the role and significance of secretory phospholipase A2（sPLA2）in peripheral blood in preterm premature rupture of membranes（pPROM）and infection of amniotic cavity.MethodsRT-PCR was used to detect the expression levels of sPLA2 mRNA in peripheral blood of 30 patients with pPROM（experimental group），30 non-full term normal pregnant patients without pPROM（normal control group）and 30 full term patients with PROM（full-term control group）before and after delivery.Fetal membranes were collected at the time of delivery of patients with pPROM for pathologic examination to determine histological chorioamnionitis（HCA）.ResultsThe expression levels of sPLA2 mRNA in peripheral blood were 1.079±0.746 and 0.651±0.481 in the experimental group and the normal control group before delivery，respectively，indicating that the expression of sPLA2 mRNA was increased in the experimental group compared with the normal control group（P=0.011）.The expression levels of sPLA2 mRNA in peripheral blood were 2.439±0.086 and 2.575±0.036 in the experimental group and the full-term control group at labor onset，respectively，indicating that there was no statistically significant difference in the level of sPLA2 mRNA in peripheral blood between the experimental group and the full-term control group at labor onset（P=0.787）.The level of sPLA2was related to chorioamnionitis in the experimental group at labor onset.ConclusionThe increase of sPLA2may participate in the pathogenesis of preterm premature rupture of membranes and is related with the infection of chorioamnionitis.

premature rupture of membranes；secretory phospholipase A2；chorioamnionitis；labor onset

R714.21

A

0258-4646（2015）06-0520-04

周洋（1988-），女，碩士研究生.

趙巖，E-mail：zhaoy@sj-hospital.org

2015-01-03

網(wǎng)絡(luò)出版時間：