楊楊，徐愛華，戴奇，張佳星，孫永新

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，沈陽 110001）

·論著·

Nrf2的失活對應(yīng)力負(fù)荷下的骨形成的影響

楊楊，徐愛華，戴奇，張佳星，孫永新

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，沈陽 110001）

目的通過核轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf2）基因敲除小鼠探索Nrf2在應(yīng)力所致骨形成中的作用。方法通過PCR檢測選取同窩雜交出生的小鼠Nrf2基因敲除（KO）組及野生（WT）組，按時給予尺骨2 Hz峰值4 000壓力連續(xù)3 d（120轉(zhuǎn)/d），測量2組尺骨相對礦化面積及相對骨形成率。結(jié)果負(fù)荷引起的骨形成在KO組小鼠中被抑制。與WT組相比，KO組小鼠的相對骨形成率降低約84%（P＜0.01）。結(jié)論骨內(nèi)Nrf2的失活將影響應(yīng)力負(fù)荷所致的骨形成。

核轉(zhuǎn)錄因子2；應(yīng)力負(fù)荷；骨形成

骨在生長過程中與成熟后，隨著內(nèi)、外環(huán)境因素的改變，在不斷進(jìn)行骨形成與破壞?；罟墙M織中存在一種反饋系統(tǒng)，能通過對外部條件變化的感受來重建骨形成。在重建過程中，應(yīng)力負(fù)荷是一個重要因素［1］。骨對應(yīng)力的改變及機(jī)械刺激高度敏感，應(yīng)力的改變及機(jī)械刺激可促進(jìn)骨形成［2］。然而，該反應(yīng)的確切機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，負(fù)荷可增加線粒體的活性，但骨細(xì)胞中活性氧水平的增高對機(jī)械誘導(dǎo)的骨形成有負(fù)面影響［3］。事實(shí)上，應(yīng)力負(fù)荷（運(yùn)動）可能會同時增加骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激和抗氧化作用［4］。然而，骨細(xì)胞受到機(jī)械刺激時，抗氧化及氧化應(yīng)激作用的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確。

核轉(zhuǎn)錄因子2（核因子E2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2，nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）是一種具有細(xì)胞抗氧化和化學(xué)刺激作用的主要調(diào)控因子，同時也是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族［5］。之前對Nfr2的研究主要集中在具有代謝和解毒功能的器官（如肝臟、腎臟）以及一些長期暴露于環(huán)境中的器官（如皮膚、肺及消化道）方面。正常靜止條件下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2被其抑制蛋白Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）禁錮在細(xì)胞質(zhì)中，該蛋白會導(dǎo)致Nrf2的蛋白酶體降解，抑制其轉(zhuǎn)錄激活活性［6］。受到氧化刺激時，Keap1被修飾，Nrf2從Keap-1釋放，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中［7］。與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合。Nrf2-ARE通路是目前公認(rèn)的抗氧化和外源性應(yīng)力的一個重要的細(xì)胞防御機(jī)制。Nrf2基因敲除小鼠更容易受到氧化刺激，表明Nrf2在保護(hù)組織器官避免毒性刺激中起著關(guān)鍵的作用。本研究擬確定Nrf2基因敲除小鼠的骨骼基因表型，并進(jìn)一步探討Nrf2在應(yīng)力所致骨形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：C57BL6/129SV混合的背景環(huán)境的雄性野生型和Nrf2基因敲除小鼠由LI Ji-liang教授（Indiana University-Purdue University Indianapolis，IUPUI，印第安納波利斯）友情提供。本研究中的所有實(shí)驗(yàn)均按照中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物要求基本條例執(zhí)行。

1.1.2 試劑與器材：鈣黃綠素、茜素、異氟醚（Sigma公司，美國），甲基丙烯酸甲酯（齊魯石化開泰，中國），電磁制動器（Endura TEC公司，美國），組織鋸（鉆石鋸）（米力光公司，中國），顯微鏡（尼康公司，日本）。

1.2 方法

通過PCR技術(shù)檢測選取Nrf2-/-與Nrf2+/+雄性小鼠21只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中，Nrf2-/-11只（KO組），Nrf2+/+10只（WT組）。對21只小鼠進(jìn)行軸向尺骨的應(yīng)力負(fù)荷實(shí)驗(yàn)和骨組織形態(tài)學(xué)檢測。

應(yīng)力負(fù)荷實(shí)驗(yàn)：采用16周齡雄性小鼠，3%異氟醚全麻下，連續(xù)3 d使用電磁制動器（Endura TEC，美國）對小鼠右前肢施加動態(tài)應(yīng)力負(fù)荷（120次/d，2 Hz，KO組峰值為2.24 N，WT組峰值為2.8 N），左前肢作為無負(fù)荷對照組，不施加負(fù)荷。在負(fù)荷施加后的飼養(yǎng)期間，允許所有小鼠在籠中正?；顒?。在第1次施加應(yīng)力負(fù)荷后的第5和第11天，分別給予小鼠腹腔注射鈣黃綠素（30 mg/kg）和茜素（50 mg/kg）。所有動物在14 d后處死。對右前肢（負(fù)荷）和左前肢（無負(fù)荷）的尺骨進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢測。

骨組織形態(tài)學(xué)檢測：將尺骨標(biāo)本浸入10%的中性甲醛緩沖液48 h后，分級乙醇脫水，二甲苯中洗滌，置入甲基丙烯酸甲酯。用鉆石鑲嵌的組織鋸在尺骨干中段橫向切斷，約20 μm厚，置于載玻片上。采用尼康顯微鏡和數(shù)字化系統(tǒng)（R&M Biometrics）觀察尺骨組織形態(tài)學(xué)。250倍鏡下收集骨膜表面數(shù)據(jù)：總周長（total perimeter，B.Pm），單標(biāo)記周長（single label perimeter，sL.Pm），雙標(biāo)記周長（double label perimeter，dL.Pm），和雙標(biāo)記區(qū)（double label area，dL.Ar）。并計(jì)算以下參數(shù)：礦化表面［MS/BS=（1/2 sL.Pm+dL.Pm）/B.Pm×100%］，礦化沉積率（MAR= dL.Ar/dL.Pm/6 days；μm/day），和骨形成率［BFR/BS= MAR×MS/BS×3.65；μm3/（μm2·year）］。此外，通過計(jì)算［右尺骨值（負(fù)荷）－左尺骨值（無負(fù)荷）］獲得一組相對值（r），如rMS/BS，rMAR和rBFR/BS。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

為了研究Nrf2在負(fù)荷誘導(dǎo)骨形成中的作用，KO組和WT組分別給予尺骨應(yīng)力負(fù)荷，并對骨形成的反應(yīng)進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，與對照組相比，KO組小鼠的相對骨形成率降低約84%（P＜0.01），見圖1。提示KO組小鼠負(fù)荷誘導(dǎo)的骨形成被抑制，表明Nrf2在負(fù)荷誘導(dǎo)的骨形成中起重要作用。

3 討論

目前的研究表明，骨中Nrf2的失活會減少骨形成，從而可能導(dǎo)致低骨量。本研究結(jié)果顯示，Nrf2基因敲除小鼠與野生型相比，負(fù)荷誘導(dǎo)的骨形成明顯受到抑制，提示Nrf2在骨的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵的作用。然而，Park等［8］對8周齡的Nrf2基因敲除小鼠進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nrf2基因敲除組比對照組具有更高的骨密度。但這項(xiàng)研究未提及實(shí)驗(yàn)動物的性別，因此，不能確定性別和年齡是否會導(dǎo)致該研究結(jié)果與本研究之間的差異。Park等［8］的研究結(jié)果顯示，Nrf2的過表達(dá)抑制了RUNX2的表達(dá)，從而可能對骨形成產(chǎn)生有害影響。例如，通過Keap基因失活導(dǎo)致Nrf2過表達(dá)的小鼠會由于食道和胃的角化性病變引起上消化道梗阻，導(dǎo)致小鼠在斷奶前死亡。Nrf2的激活會導(dǎo)致小鼠肝損傷，延緩干細(xì)胞增殖，增加干細(xì)胞凋亡，從而阻礙肝再生［9］。在角質(zhì)形成細(xì)胞中，Nrf2的激活能引起包括脫發(fā)在內(nèi)的皮膚異常［10］。這些研究表明，細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)激活對機(jī)體各系統(tǒng)均可有不同程度的影響。

本研究通過應(yīng)力負(fù)荷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了Nrf2在小鼠骨形成中的關(guān)鍵作用。在本研究中，Nrf2基因的敲除抑制了機(jī)械誘導(dǎo)（負(fù)荷）的小鼠骨形成。礦化表面（MS/BS）和骨礦沉積率（MAR）的減少表明Nrf2的缺乏抑制了成骨細(xì)胞的增長和活性。既往的研究表明，機(jī)械負(fù)荷能增加成骨細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激作用，而運(yùn)動也可導(dǎo)致骨內(nèi)抗氧化作用的增強(qiáng)［11］。為了對抗微環(huán)境中的各種損傷，細(xì)胞在進(jìn)化過程中逐漸獲得了對抗各種毒性作用損傷的防御機(jī)制，其中最重要的細(xì)胞防御機(jī)制就是通過轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)節(jié)的［12］。而運(yùn)動誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和抗氧化作用是同時進(jìn)行的，或者抗氧化作用是在運(yùn)動過程中對氧化應(yīng)激產(chǎn)生的反應(yīng)，目前仍不清楚［13］?？梢酝茰y，如果抗氧化系統(tǒng)在機(jī)械負(fù)荷時受損，氧化應(yīng)激作用就可能會過度增加，增加的氧化應(yīng)激作用可能會通過拮抗Wnt信號分子，例如Wnt5，一個非經(jīng)典的Wnt配體，而對骨形成的合成代謝產(chǎn)生影響，從而進(jìn)一步破壞負(fù)荷誘導(dǎo)的骨形成。本研究結(jié)果表明，如果骨細(xì)胞內(nèi)沒有Nrf2表達(dá)，則負(fù)荷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用不能緩解。因此，推測Nrf2對應(yīng)力負(fù)荷后的骨形成的影響是通過抗氧化作用完成的。Nrf2基因敲除小鼠模型的建立有利于系統(tǒng)地研究Nrf2相關(guān)的遺傳病。為了更好地研究Nrf2基因在破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞等不同細(xì)胞群中的特定作用，Nrf2特定基因缺失小鼠模型的建立十分必要。Nrf2特定基因缺失小鼠模型將更加有利于研究Nrf2在骨的穩(wěn)態(tài)及負(fù)荷誘導(dǎo)的骨形成中的作用機(jī)制。

圖1 WT組和KO組內(nèi)負(fù)荷及非負(fù)荷小鼠尺骨中段形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果Fig.1 Results of morphologic detection of midshaft ulnar sections from the non-loaded and loaded forearms of the wild type control and the Nrf2KO mice

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Nrf2的功能缺失能夠引起負(fù)荷誘導(dǎo)的骨形成代謝反應(yīng)減少，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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（編輯王又冬）

Inactivation of Nrf2 Decreases Load-driven Bone Formation

YANG Yang，XU Ai-hua，DAI Qi，ZHANG Jia-xing，SUN Yong-xin

（Department of Rehabilitation，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate the role of nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2（Nrf2）in load-driven bone metabolism in Nrf2knockout（KO）mice.MethodsThe hybridized mice in the same brood were selected through PCR detection and were divided into two groups，i.e.，the Nrf2 knockout（KO）group and the wild-type（WT）group.Ulna of mice was loaded with 4 000 peak microstrains at 2 Hz for 3 consecutive days（120 cycles/day）as scheduled，the relative mineralizing surface（rMS/BS）and the relative bone formation rate（rBFR/BS）of ulna were measured for the two groups.ResultsLoad-induced bone formation was suppressed in KO mice.Compared to the WT control，the relative bone formation rate was roughly 84% lower in KO mice（P＜0.01）.ConclusionThe loss-of-function mutation of Nrf2 in bone diminishes load-driven bone formation.

Nrf2；loading-driven；bone formation

R493

A

0258-4646（2015）06-0513-03

沈陽市科技技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（113882）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目社會發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2010225034）

楊楊（1987-），女，醫(yī)師，碩士.

孫永新，E-mail：sunyxjp@hotmail.com

2015-01-26

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