王齊暉，滿冬亮，何川，程仕彤

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，沈陽 110001）

·論著·

孕激素和維生素D對激素依賴性乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其相互作用

王齊暉，滿冬亮，何川，程仕彤

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，沈陽 110001）

目的探討孕激素對激素依賴性乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，觀察不同水平維生素D以及孕激素對激素依賴性乳腺癌細(xì)胞系T-47D細(xì)胞增殖的共同作用及二者之間的相互作用。方法將培養(yǎng)的T-47D細(xì)胞分為單純高、低濃度孕激素處理組，觀察孕激素對激素依賴性乳腺癌細(xì)胞增殖的影響；設(shè)單純高、低濃度維生素D處理組，觀察維生素D對T-47D細(xì)胞增殖的影響；設(shè)高、低濃度孕激素與高、低濃度維生素D處理組，采用兩因素兩水平平行析因?qū)嶒炘O(shè)計，觀察不同水平維生素D及孕激素對T-47D細(xì)胞增殖的共同作用，對照組為正常培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞。采用MTT法檢測各組吸光度，觀察細(xì)胞生長凋亡情況。結(jié)果高、低濃度孕激素處理組細(xì)胞濃度均顯著高于對照組，且低濃度孕激素處理組細(xì)胞濃度顯著高于高濃度孕激素處理組（P＜0.05）；雙低組（低濃度維生素D、低濃度孕激素處理組）細(xì)胞濃度顯著低于其他3個雙因素處理組及對照組（P＜0.05）。結(jié)論孕激素對激素依賴性乳腺癌細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。維生素D和孕激素存在相互作用，且這種相互作用根據(jù)二者的濃度不同而有所變化，提示孕激素對乳腺癌細(xì)胞的雙向作用可能與孕激素和（或）其他因素的濃度有關(guān)，但其具體機(jī)制尚不明確。

孕激素；維生素D；乳腺癌；增殖

乳腺癌是常見的腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性健康。自20世紀(jì)70年代末開始，全球乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢。2009年我國腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第1位，發(fā)病率（粗率）合計42.55/10萬，城市為51.91/10萬，農(nóng)村為23.12/10萬［1］。

根據(jù)激素受體的表達(dá)情況，乳腺癌分為激素依賴性乳腺癌和激素非依賴性乳腺癌，其中以前者居多。目前，乳腺癌的內(nèi)科治療以內(nèi)分泌療法為主，即采用雌激素抑制劑阻斷激素對腫瘤細(xì)胞生長侵襲的促進(jìn)作用。但內(nèi)分泌療法僅對50%～60%的激素依賴性乳腺癌患者有效，且只對不到10%的激素非依賴性乳腺癌患者有效，其原因尚不明確。

維生素D除能夠調(diào)節(jié)人體內(nèi)的鈣磷代謝外，還能通過與其受體（vitamin D receptor，VDR）結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞生長和血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，血清中維生素D含量與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)，晚期乳腺癌患者血液中維生素D水平極低［2］。體外實驗表明，活性維生素D與其模擬物能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長［3～6］。研究發(fā)現(xiàn)，某些維生素D匱乏的中晚期乳腺癌患者內(nèi)分泌治療或化療療效欠佳，而補(bǔ)充維生素D后療效提升，且這種效果對于激素依賴性乳腺癌患者尤為明顯。由此推測，維生素D與能夠影響激素依賴性乳腺癌細(xì)胞生長凋亡的激素之間可能存在某種負(fù)相關(guān)的聯(lián)系，而這種相互作用能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的生長增殖、凋亡和各種治療方案的療效產(chǎn)生一定影響。

能夠?qū)に匾蕾囆匀橄侔┘?xì)胞產(chǎn)生作用的最明確的激素為雌激素和孕激素，此外，垂體激素可能也會有一定作用［7］。促進(jìn)激素依賴性乳腺癌細(xì)胞生長增殖作用最為明確的是雌激素，而孕激素對激素依賴性乳腺癌的作用卻廣存爭議，有促進(jìn)和抑制2種截然相反的結(jié)論。使孕激素對激素依賴性乳腺癌產(chǎn)生相反作用的決定性的實驗條件尚不明確。本研究擬采用典型的激素依賴性乳腺癌細(xì)胞系（T-47D）細(xì)胞，探討不同水平孕激素對其影響；再進(jìn)行兩因素兩水平平行析因?qū)嶒?，探討維生素D與孕激素之間的相互作用以及對細(xì)胞產(chǎn)生的綜合作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：維生素D3注射液（上海通用藥物股份能有限公司）；黃體酮（孕激素）注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；DMEM（Thermo SCIENTIFIC賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；胰酶（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）。

1.1.2 人乳腺癌細(xì)胞株T47D：購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 方法

1.2.1 試劑的配制：用倍比稀釋法將維生素D3注射液（7.5 mg/mL）、黃體酮注射液（10 mg/mL）配制成20 mL含不同濃度藥物的DMEM培養(yǎng)基（表1）。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：T47D細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞傳代備用，4～5 d傳代1次。

1.2.3 細(xì)胞分組：設(shè)單純高、低孕激素處理組（vd-pr++組、vd-pr+組）觀察孕激素對激素依賴性乳腺癌細(xì)胞增殖的影響；設(shè)單純高、低維生素D處理組（vd++pr-組、vd+pr-組）觀察維生素D對激素依賴性乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，對照組為未添加維生素D和孕激素的正常培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞；設(shè)高、低孕激素與高、低維生素D處理組，即vd++pr++組、vd+pr++組、vd++pr+組、vd+pr+組，采用兩因素兩水平平行析因?qū)嶒炘O(shè)計，觀察不同水平維生素D和孕激素對T-47D細(xì)胞增殖的共同作用，對照組為正常培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞。

表1 藥物濃度（ng/mL）Tab.1 Drug concentration（ng/mL）

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞生長凋亡情況：各組均同時同生長條件培養(yǎng)6 d，每24 h取對數(shù)生長期細(xì)胞3瓶，棄DMEM培養(yǎng)基，生理鹽水涮洗后，用胰酶消化約1 min。加入6 mL DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為4×105/mL，平均分成8組，每組4個復(fù)孔，共5板。離心，加入提前配好的DMEM培養(yǎng)基3.6 mL混勻，加入96孔板（100 μL/孔）。于5%CO2、37℃溫箱中分別孵育24、48、72、96、120 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。每天取1板，加入0.5%MTT溶液（20 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）和對照孔（藥物處理孔）。酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光度值（OD490nm）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用ANOVA分析方法判斷孕激素作用下維生素D對乳腺癌細(xì)胞的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與vd-pr-組相比，vd-pr+組和vd-pr++組的吸光度值顯著增高（P＜0.05）；vd+pr+組的吸光度值顯著降低（P＜0.05）；其余各組均無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1，圖1。與vd-pr++組相比，vd-pr+組的吸光度值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.028）。

表1 各組細(xì)胞吸光度值的比較（）Tab.1 The comparison of absorbance between each group of cells（）

表1 各組細(xì)胞吸光度值的比較（）Tab.1 The comparison of absorbance between each group of cells（）

Group OD490nm P vd-pr- 0.75±0.29 vd-pr+ 1.66±0.25 0.000 vd-pr++ 1.31±0.16 0.001 vd++pr- 0.79±0.11 0.791 vd++pr+ 0.85±0.22 0.492 vd++pr++ 0.69±0.16 0.735 vd+pr- 0.59±0.03 0.303 vd+pr+ 0.43±0.05 0.042 vd+pr++ 0.89±0.11 0.343

圖1 各組細(xì)胞的生長狀態(tài)Fig.1 Growing status of each group

與vd+pr+組相比，vd++pr+組、vd+pr++組及vd++pr++組的吸光度值顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 雙因素處理組與vd+pr+組吸光度值的比較（）Tab.2 The comparison of absorbance between two-factor treated groups and vd+pr+group（）

表2 雙因素處理組與vd+pr+組吸光度值的比較（）Tab.2 The comparison of absorbance between two-factor treated groups and vd+pr+group（）

Group OD490nm P vd++pr+ 0.85±0.22 0.010 vd+pr++ 0.89±0.11 0.005 vd++pr++ 0.69±0.16 0.025

3 討論

本研究結(jié)果表明，孕激素能夠促進(jìn)激素依賴性乳腺癌細(xì)胞增殖。首先，孕激素是乳腺發(fā)育所必需的類固醇激素，通過與其特異性受體結(jié)合調(diào)控乳腺組織的正常發(fā)育，促進(jìn)乳腺小葉及腺泡生長，促進(jìn)乳腺上皮增殖［8］。而在絕經(jīng)后長期接受激素補(bǔ)充治療婦女的乳腺組織學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，雌激素聯(lián)合能明顯增加終末導(dǎo)管小葉細(xì)胞的增殖率，這種作用比單一雌激素治療明顯，且隨著激素治療時間延長而增強(qiáng)。Pike等［9］認(rèn)為對更年期婦女施以激素補(bǔ)充治療，其患乳腺癌的風(fēng)險不同：單獨服用雌激素則風(fēng)險每5年增加10%，而聯(lián)合服用雌激素和孕激素，風(fēng)險每5年將增加29%。另有研究指出，接受雌孕激素復(fù)合制劑療法（HRT）的婦女罹患侵襲性乳腺癌的風(fēng)險增高，而僅接受雌激素療法（ERT）的婦女患乳腺癌的風(fēng)險未增加。這些研究間接支持了孕激素對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，在BRCA1低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中，孕激素大量積累，導(dǎo)致乳腺細(xì)胞過度增殖，促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，而使用孕酮拮抗劑可防止或推遲乳腺癌發(fā)展［10］。還有研究指出孕激素可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，且推論BRCA1可能通過下調(diào)孕激素受體表達(dá)抑制由孕激素所致乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移，解釋了BRCA1缺失或低表達(dá)的人群更易罹患乳腺癌且病情發(fā)展更快的原因。研究認(rèn)為孕激素能刺激雙調(diào)蛋白的增加，并與雙調(diào)蛋白一起經(jīng)由表皮生長因子受體途徑激活細(xì)胞內(nèi)通路，促進(jìn)正常和腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。

而另有研究者通過實驗表達(dá)了相反的觀點。研究者通過基因分析發(fā)現(xiàn)激素非依賴性乳腺癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染雌激素受體后，雌激素能抑制多種與乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，并且能刺激多種腫瘤抑制因子的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［9］。也有許多研究結(jié)果間接地支持了這一論點，如有研究表明術(shù)后復(fù)發(fā)率與孕激素濃度值呈顯著負(fù)相關(guān)［2］，孕激素能下調(diào)雌激素和孕激素受體的生成［13］，孕激素高表達(dá)預(yù)示患者有較高的生存率和較長的生存期，以及乳腺癌手術(shù)前單次大劑量注射孕激素對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的生存期有改善作用等［9］。而臨床乳腺癌治療中也將大劑量的孕激素類（如甲孕酮和甲地孕酮等）用于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌的解救治療或與化療合用以提高療效，減輕化療不良反應(yīng)。其中，甲孕酮對治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌療效肯定，當(dāng)TAM治療失敗時改用甲孕酮仍有較高的有效率。雌激素受體和孕激素受體均表達(dá)者有效率可達(dá)50%，只表達(dá)孕激素受體而不表達(dá)雌激素受體者也有20%～30%的有效率。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度孕激素對激素依賴性乳腺癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用明顯低于低濃度孕激素，而更高的濃度是否可以逆轉(zhuǎn)促進(jìn)作用尚不可知，但提示了孕激素的濃度或局部濃度有可能是影響其對乳腺癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用的重要原因之一。

本研究結(jié)果還表明，維生素D處理組雖然沒能明顯抑制T47D細(xì)胞的生長，但維生素D的存在顯著降低了孕激素對T47D細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。根據(jù)報道的維生素D和孕激素的獨立作用，即高濃度維生素D抑制作用大，高濃度孕激素促進(jìn)作用小，預(yù)測的結(jié)果應(yīng)當(dāng)是高濃度維生素D和高濃度孕激素的聯(lián)合作用組對細(xì)胞增殖的抑制作用最明顯，而事實卻恰好相反，低濃度維生素D和低濃度孕激素聯(lián)合作用組才是抑制作用最明顯的，也是在實驗結(jié)束時與對照組相比唯一細(xì)胞數(shù)顯著減少的處理組。而其他3組的發(fā)展趨勢則非常相近，在實驗結(jié)束時細(xì)胞數(shù)幾乎與對照組相同。提示孕激素和維生素D之間必然存在著某種作用，使雙低濃度下的細(xì)胞受到了明顯的抑制甚至打擊，而其他處理組，包括預(yù)測中本應(yīng)是效果最好的一組，抑制作用幾乎相同，最后的細(xì)胞數(shù)都與對照組相近，即最終經(jīng)由某種機(jī)制，維生素D和孕激素間的相互作用使維生素D降低了孕激素的促進(jìn)作用；另一方面，在雙低組中，二者的相互作用經(jīng)由某種途徑使維生素D對細(xì)胞的抑制作用得到了加成的效果。在實驗初期，鏡下觀察幾乎未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，而隨著實驗的進(jìn)行，凋亡細(xì)胞逐漸增多，所有處理組均如此，然而最終卻只有雙低處理組的細(xì)胞數(shù)顯著降低，說明只有這組的凋亡數(shù)大于增殖數(shù)，可能是因為維生素D促凋亡的作用得到了提升，或孕激素的促增殖作用被降低，當(dāng)然也可能是孕激素對維生素D促凋亡作用的抑制被抵消。

綜上所述，本研究證實了孕激素對激素依賴性乳腺癌細(xì)胞具有促增殖作用，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了維生素D和孕激素存在相互作用，且這種相互作用隨二者的濃度不同而有所變化。孕激素對乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的雙向作用有可能與孕激素和（或）其他因素的濃度有關(guān)，但其具體相互作用關(guān)系和機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步深入研究。

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（編輯王又冬）

Influence of Progesterone and Vitamin Don the Cell Proliferation of Hormone-dependent Breast Cancer and the Interaction

WANG Qi-hui，MAN Dong-liang，HE Chuan，CHENG Shi-tong

（Department of Laboratory Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To study the influence of progesterone on the cell proliferation of hormone-dependent breast cancer and observe the co-effect of vitamin D and progesterone of different levels on the proliferation of the cell line T-47D in hormone-dependent breast cancer and the interaction between vitamin D and progesterone.MethodsThe cultured T-47D cells were divided into the high and the low progesterone mono-treated groups to observe the effects of different levels of progesterone on the cell proliferation of hormone-dependent breast cancer cell line（T-47D）.The high and the low vitamin D mono-treated groups were set to observe the effects of different levels of vitamin D on the cell proliferation.Groups treated by different levels of progesterone combined with vitamin D were set to observe the interaction between them.Normal breast cancer cells were set as the control group.The two-factor two-level parallel factorial experiment was conducted to observe the co-effect of different levels of progesterone and vitamin D on the proliferation of T-47D.The growth and apoptosis of cells was observed through detection of absorbance in each group by MTT.ResultsThe cell concentration in high and low progesterone treated groups was increased than that in the control group，and was increased in the low progesterone treated group compared with the high progesterone treated group（P＜0.05）.The cell concentration in dual-low level treated group was decreased than that in the other three groups which were two-factor treated and the control group（P＜0.05）.ConclusionProgesterone stimulates the cell proliferation of hormone-dependent breast cancer.The concentration-based interaction between vitamin Dand progesterone indicates that the bidirectional effect of progesterone on breast cancer cells may be related to the concentration of progesterone and other factors，but the specific interaction and the mechanism is unclear.

progesterone；vitamin D；breast cancer；proliferation

R737.9

A

0258-4646（2015）06-0509-04

2013年度留學(xué)人員科技活動擇優(yōu)資助項目；沈陽市科技計劃項目人口與健康科技攻關(guān)專項（F14-158-9-34）

王齊暉（1984-），男，檢驗師，本科.

程仕彤，E-mail：stdyefeng@hotmail.com

2015-04-01

網(wǎng)絡(luò)出版時間：