劉陽，王占友，池志宏，王濤

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心，遼寧 錦州 121000；2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽 110001；3.東北大學(xué)生命健康科學(xué)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，沈陽 110015）

·論著·

SLC30A8基因rs13266634 C/T單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病易感性的相關(guān)性研究

劉陽1，2，王占友2，3，池志宏2，王濤3

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心，遼寧 錦州 121000；2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽 110001；3.東北大學(xué)生命健康科學(xué)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，沈陽 110015）

目的探討SLC30A8基因rs13266634 C/T單核苷酸多態(tài)性（SNP）與錦州地區(qū)2型糖尿?。═2DM）易感性之間的相關(guān)性。方法基于病例-對照分析，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）-高分辨率溶解曲線（HRM）方法對錦州地區(qū)136例2型糖尿病患者（T2DM組）和145例健康對照（NC組）SLC30A8基因rs13266634位點的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測。結(jié)果CC基因型頻率T2DM組（38.23%）高于NC組（22.07%）；C等位基因頻率T2DM組（61.76%）高于NC組（51.03%），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；等位基因C增加了2型糖尿病1.550倍患病風(fēng)險（OR=1.550，95%CI：1.108～2.169，P＜0.05）。結(jié)論SLC30A8基因rs13266634 C/T單核苷酸多態(tài)性與錦州地區(qū)T2DM的發(fā)病相關(guān)，C是風(fēng)險等位基因。

SLC30A8基因；單核苷酸多態(tài)性；高分辨率溶解曲線；2型糖尿病

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）具有明顯的遺傳傾向，其遺傳度為31%～69%［1］，屬于復(fù)雜的多基因遺傳病。基于全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS），在法國人群中首次發(fā)現(xiàn)SLC30A8基因和2型糖尿病相關(guān)［2］。隨后，在不同種群開展了其重復(fù)研究與薈萃分析［3～6］，研究結(jié)果顯示，SLC30A8基因的rs13266634是與2型糖尿病最相關(guān)的遺傳易感位點。由于種族和地域的差異，所得研究結(jié)果也不盡相同［7］。因此，本文基于病例-對照研究，通過聚合酶鏈反應(yīng)-高分辨率溶解曲線法［8］檢測SLC30A8基因rs13266634 C/T遺傳位點的單核苷酸多態(tài)性，旨在探討錦州地區(qū)人群中此位點的分布及對2型糖尿病的風(fēng)險預(yù)測。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2013年12月至2014年12月遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院門診就診的T2DM患者（T2DM組）136例，皆為北方地區(qū)漢族，并且彼此無任何親緣關(guān)系。男65例，女71例，平均年齡（51.42±10.23）歲；排除嚴(yán)重的心肝腎疾病患者，患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。另外，選取同一時期門診就診的健康體檢正常人145例為正常對照（NC組），其中男69例，女76例，平均年齡（52.63±13.21）歲。2組在年齡和性別構(gòu)成上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。均取得所有研究對象的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器：基因組DNA提取試劑；2×PCR Reaction Mix（上海申能博彩生物科技有限公司）。SYTO?9 green fluorescent nucleic acid stain（InvitrogenTM-MolecularProbesTM，美國）；Rotor-Gene熒光定量PCR儀器（Corbett公司），凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），凝膠電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.2.2 基因組DNA的提?。翰捎贸Ｒ?guī)苯酚-氯仿法進(jìn)行基因組DNA提取作為模板，并對DNA含量進(jìn)行分析、測定，-80℃保存，備用。

1.2.3 引物設(shè)計：根據(jù)UCSC genome browser（http：// genome.ucsc.edu/）獲得所需 SLC30A8基因的rs13266634SNPs的資料，基于PRIMER5.0設(shè)計高分辨率溶解曲線（high resolution melting，HRM）引物。引物設(shè)計原則確保擴增產(chǎn)物片段控制在50～200 bp。

1.2.4 PCR-HRM反應(yīng)體系建立：根據(jù)文獻(xiàn)［8］，建立相應(yīng)的PCR-HRM反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系25 μL，2×PCR的反應(yīng)MIX 12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，5 μmol/L SYTO9熒光染料7.5 μL，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸30 s，共40循環(huán)，72℃終末延伸5 min。HRM反應(yīng)參數(shù)：94℃變性1 min，40℃復(fù)性3 min，HRM 70～90℃，以0.05℃/s的斜率采集溶解曲線，在Rotor-Gene熒光定量PCR儀器基因掃描軟件模塊上進(jìn)行分析。

1.2.5 HRM的基因分型：利用Tm溫度的差異，直接區(qū)分樣本對應(yīng)的基因型純合子和雜合子；但不足以區(qū)分不同純合子之間Tm的差異［9］；采用參入法［10］進(jìn)行區(qū)分不同純合子分型，即在純合子基因中摻入已知純合子基因型，若與已知純合子基因型相同表現(xiàn)為純合子型曲線，相反表現(xiàn)為雜合子曲線，以達(dá)到區(qū)分不同純合子基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Haploview4.0軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。組間基因型及等位基因頻率的分布差異采用χ2檢驗；多態(tài)性位點與2型糖尿病易感性的分析采用比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（CI）表示。所有統(tǒng)計學(xué)分析均采用雙尾概率檢測，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 SLC30A8基因型rs13266634 SNP的HRM基因分型結(jié)果

T2DM組模板DNA經(jīng)PCR-HRM基因分型后得到3種基因型（雜合子型CT、純合子型CC、純合子型TT），見圖1～4。

圖1 SLC30A8-rs13266634-T2DM-HRMFig.1 SLC30A8 rs13266634-T2DM-HRM

圖2 SLC30A8-rs13266634-T2DM-雜合MeltFig.2 SLC30A8 rs13266634-T2DM-heterozygotic Melt

圖3 SLC30A8-rs13266634-T2DM-純合MeltFig.3 SLC30A8rs13266634-T2DM-homozygotic Melt

圖4 SLC30A8-rs13266634-T2DM-純合造雜合HRMFig.4 SLC30A8 rs13266634-T2DM-forged heterozygotic Melt

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

采用Hardy-Weinberg平衡法檢驗SLC30A8基因rs13266634 C/T多態(tài)性位點均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，證明本研究人群已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。見表1。

2.3 rs13266634 C/T多態(tài)性位點基因型和等位基因型頻率分布比較

如表2所示，CC基因型頻率T2DM組高于NC組，且各基因型分布頻率在2組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=8.838，P=0.012）。兩組C等位基因頻率比較，T2DM組高于NC組，并且各等位基因型分布頻率2組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=6.566，P=0.010）。

表1 SLC30A8基因rs13266634 C/T多態(tài)性位點Hardy-Weinberg平衡檢驗Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium test of the rs13266634 C/T locus in SLC30A8gene

表2 SLC30A8基因rs13266634 C/T多態(tài)性位點基因型和等位基因型頻率分布比較［n（%）］Tab.2 Genotype and allele frequencies of the rs13266634 C/T locus in SLC30A8gene［n（%）］

2.4 SLC30A8 SNP位點基因型和等位基因與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險的預(yù)測

SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態(tài)性遺傳位點的CC基因型與2型糖尿病的聯(lián)系強度OR值為1.452（95%CI：1.150～1.833，P＜0.05），意味著增加了2型糖尿病1.452倍患病風(fēng)險。并且等位基因C與2型糖尿病的聯(lián)系強度OR值為1.550（95%CI：1.108～2.169，P＜0.05），即增加了2型糖尿病1.550倍患病風(fēng)險。

3 討論

本研究在錦州地區(qū)的人群中初步驗證了文獻(xiàn)報道的SLC30A8的rs13266634 C/T的單核苷酸多態(tài)性，并且證實了rs13266634與T2DM易患性相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：不同于印度地區(qū)人群［7］，錦州地區(qū)T2DM組的rs13266634 C/T的CC基因型頻率和C等位基因頻率均高于NC組，這一結(jié)果與中國漢族人群相似［3］，說明存在地域和種族的差異。與此同時，等位基因C在兩組之間的分布存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），等位基因C增加了2型糖尿病1.550倍患病風(fēng)險。

研究顯示，人類ZnT-8 DNA編碼序列被發(fā)現(xiàn)在AC027419重疊區(qū)，SLC30A8作為鋅轉(zhuǎn)運體家族的一員，可定位在人8q24.11染色體上。包含8個外顯子，全長37 kb，編碼368個氨基酸蛋白。特異性的在胰島β細(xì)胞高表達(dá)，位于胰島素分泌顆粒膜中，能夠促進(jìn)鋅離子在胰島素分泌囊泡中聚集［11］，是參與胰島素儲存、合成、分泌的重要成分。定位于SLC30A8基因第8外顯子的rs13266634多態(tài)性屬于非同義突變，是由單個核苷酸改變引起的，即Arg325變異成Trp325（R325W）［7］。這一結(jié)果可能發(fā)生鋅離子與胰島素分子結(jié)合不穩(wěn)，影響胰島素儲存、合成和分泌，導(dǎo)致胰島素功能改變，增加T2DM的發(fā)病概率［12］。而本研究的結(jié)果也證實了SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態(tài)性位點與2型糖尿病易感性相關(guān)，統(tǒng)計分析顯示SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態(tài)性遺傳位點的CC基因型與2型糖尿病的聯(lián)系強度OR值為1.452（95%CI：1.150～1.833，P＜0.05）；并且等位基因C與2型糖尿病的聯(lián)系強度OR值為1.550（95%CI：1.108～2.169，P＜0.05），可以推測SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態(tài)性遺傳位點的CC基因型和等位基因C能夠增加2型糖尿病的患病風(fēng)險。

由于本研究人群量和人群覆蓋地區(qū)有限，所得結(jié)果驗證了SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態(tài)性位點在錦州地區(qū)人群中的存在；并且與2型糖尿病易感性相關(guān)。CC基因型及等位基因C是2型糖尿病的風(fēng)險因素，但仍需擴大研究樣本進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。盡管SLC30A8是目前2型糖尿病的GWAS研究中易感基因之一，但是其導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)病的病理生理機制不明，進(jìn)一步研究其機制對糖尿病的預(yù)防及治療具有重要的臨床意義。

［1］Almgren P，Lehtovirta M，Isomaa B，et al.Heritability and familiality of type 2 diabetes and related quantitative traits in the Botnia Study［J］.Diabetologia，2011，54（11）：2811-2819.

［2］Sladek R，Rocheleau G，Rung J，et al.A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes［J］.Nature，2007，445（7130）：881-885.

［3］Chang YC，Liu PH，Yu YH，et al.Validation of type 2 diabetes risk variants identified by genome-wide association studies in Han Chinese population：a replication study and meta-analysis［J］.PLoS One，2014，9（4）：1-8.

［4］Parra EJ，Below JE，Krithika S，et al.Genome-wide association study of type 2 diabetes in a sample from Mexico City and a metaanalysis of a Mexican-American sample from Starr County，Texas［J］.Diabetologia，2011，54（8）：2038-2046.

［5］Voight BF，Scott LJ，Steinthorsdottir V，et al.Twelve type 2 diabetes susceptibility loci identified through large-scale association analysis［J］.Nat Genet，2010，42（7）：579-589.

［6］Gamboa-Melendez MA，Huerta-Chagoya A，Moreno-Macias H，et al. Contribution of common genetic variation to the risk of type 2 diabetes in the Mexican Mestizo population［J］.Diabetes，2012，61（12）：3314-3321.

［7］Kommoju UJ，Maruda J，Kadarkarai S，et al.No detectable association of IGF2BP2 and SLC30A8 genes with type 2 diabetes in the population of Hyderabad，India［J］.Meta Gene，2013，1：15-23.

［8］Erali M，Wittwer CT.High resolution melting analysis for gene scanning［J］.Methods，2010，50（4）：250-261.

［9］Wittwer CT，Reed GH，Gundry CN，et al.High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen［J］.Clin Chem，2003，49（6 Pt 1）：853-860.

［10］Liew M，Seipp M，Durtschi J，et al.Closed-tube SNP genotyping without labeled probes/a comparison between unlabeled probe and amplicon melting［J］.Am J Clin Pathol，2007，127（3）：341-348.

［11］Chimienti F，Devergnas S，F(xiàn)avier A，et al.Identification and cloning of a beta-cell-specific zinc transporter，ZnT-8，localized into insulin secretory granules［J］.Diabetes，2004，53（9）：2330-2337.

［12］Ng MC，Park KS，Oh B，et al.Implication of genetic variants near TCF7L2，SLC30A8，HHEX，CDKAL1，CDKN2A/B，IGF2BP2，and FTO in type 2 diabetes and obesity in 6，719 Asians［J］.Diabetes，2008，57（8）：2226-2233.

（編輯武玉欣）

Research on Correlation between rs13266634 C/TSNP of SLC30A8Gene and Susceptibility to
Type 2 Diabetes Mellitus

LIUYang1，2，WANG Zhan-you2，3，CHI Zhi-hong2，WANG Tao3

（1.Center of Medical Laboratory，The Third Hospital Affiliated to Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China；2.Department of Pathophysiology，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.The Institute of Neurosciences，College of Life and Health Sciences，Northeastern University，Shenyang 110015，China）

Objective To investigate the correlation between the rs13266634 C/T SNP of SLC30A8and T2DM in Jinzhou.MethodsBased on case-control study，PCR-HRM was used to identify the genotypes of rs13266634 of SLC30A8gene in 136 cases of T2DM patients and 145 cases of healthy control in Jinzhou.ResultsThe CC genotypic frequency and C allele frequency in T2DM（38.23%and 61.76%）were higher than those of healthy control（22.07%and 51.03%）.Furthermore，there was significant difference in case-control study from the population in Jinzhou（P＜0.05）.The odds ratio of allele C for T2DM was 1.550（95%CI：1.108-2.169，P＜0.05）.ConclusionThe single nucleotide polymorphism of the rs13266634 locusin SLC30A8 gene was correlated with T2DM susceptibility in Jinzhou，and the allele C was a risk allele.

SLC30A8gene；single nucleotide polymorphism；high-resolution melting curve；type 2 diabetes mellitus

R587.1

A

0258-4646（2015）06-0494-04

國家自然科學(xué)基金（81170775）

劉陽（1975-），女，主管技師，碩士研究生. E-mail：jykly43@aliyun.com

2015-01-12

網(wǎng)絡(luò)出版時間：