李儒華，余錦強

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院,湖北 十堰 442000)

VEGF和PEDF在不同病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病理改變中表達的意義

李儒華，余錦強

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院,湖北 十堰 442000)

目的 探討血管上皮生長因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)在不同病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達情況。方法 將雄性SD大鼠120只按照隨機數(shù)字表格法劃分為正常對照組與糖尿病組，每組60只。將糖尿病大鼠按照一次性腹腔注射鏈脲佐菌素方法制作成糖尿病模型。成模后1，3，5個月 分別應(yīng)用透射電鏡切片、視網(wǎng)膜EB含量測定法觀測大鼠視網(wǎng)膜的病理變化情況，同時應(yīng)用Western-blot 技術(shù)以及免疫組化染色測定糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中VEGF、PEDF表達情況。結(jié)果 EB染色顯示正常對照組大鼠的視網(wǎng)膜血管形態(tài)較好；1個月時糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管較規(guī)則；3個月時糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管迂曲，有部分改變；成膜后5個月時糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管迂曲已經(jīng)十分明顯，且走行不規(guī)則，血管粗細不均。同時成模后1，3，5個月糖尿病組大鼠EB含量均高于正常對照組(P均<0.05)，且隨病程進展，其含量也增加。免疫組化顯示糖尿病大鼠VEGF的陽性染色會隨病程進展而有所增強，光密度值增大；PEDF陽性染色則隨病情進展而減弱，同時光密度值減?。慌c正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。Western-blot法檢測顯示隨著病情進展，糖尿病組各階段大鼠的視網(wǎng)膜VEGF蛋白含量隨之增加，而PEDF蛋白則減少，與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 最早可觀察到的視網(wǎng)膜病變是視網(wǎng)膜細胞超微結(jié)構(gòu)病理變化，會隨病情進展加重；視網(wǎng)膜血管形態(tài)在病情中后期會發(fā)生變化，且隨病情加重而加重；在初期，視網(wǎng)膜的VEGF與PEDF表達已經(jīng)失衡，且隨病情進展，VEGF表達增加，PEDF表達減少，二者失衡貫穿于整個病情的發(fā)展過程中。

糖尿病性視網(wǎng)膜病變；血管上皮生長因子；色素上皮衍生因子

目前，對于糖尿病視網(wǎng)膜病(DR)的治療以及早期干預(yù)還沒有較好的途徑和方案，而其危害性又不容忽視，其發(fā)病機制以及防治措施已經(jīng)成為當(dāng)前研究的重點。目前研究證實，DR發(fā)病機制復(fù)雜，是多種途徑共同作用的結(jié)果，其與細胞因子、氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白激酶C的激活以及糖基化終末產(chǎn)物堆積、多元醇通路出現(xiàn)異常均有關(guān)[1]。在諸多因素中，細胞因子對于DR病程的進展起到了重要的作用，在正常狀態(tài)下，機體所表達的細胞因子處于動態(tài)平衡，在病理狀態(tài)下平衡被打破，細胞因子失衡，進而引發(fā)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及功能變化[2-3]。因此研究這些與DR有關(guān)的細胞因子就顯得尤為重要，這些因子在整個發(fā)病過程及發(fā)病機制中的作用都關(guān)系到對病情的控制。色素上皮衍生因子(PEDF)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)被認為是新生血管抑制因子系統(tǒng)與血管刺激因子系統(tǒng)的典型代表，二者的平衡對視網(wǎng)膜的功能及結(jié)構(gòu)有重要意義[4-5]。但目前對這2種因子的研究尚缺乏理論支持，當(dāng)前最為廣泛的研究也多集中在增生性DR中，對臨床前期以及非增生性視網(wǎng)膜病變的研究尚少[6]。本研究觀察了VEGF與PEDF在DR大鼠視網(wǎng)膜中的表達情況，分析了二者在DR發(fā)生發(fā)展中的作用，旨在為臨床提供理論依據(jù)。

1 實驗資料

1.1 主要儀器與試劑 伯樂公司Bio-Rad680酶標(biāo)儀；尼康公司熒光顯微鏡；美國 Sigma 公司高速冷凍離心機；強生公司血糖試紙；白云山制藥公司尿糖試紙以及PVDF轉(zhuǎn)移膜等。美國Sigma 公司的鏈脲佐菌素；北京中杉金橋公司的免疫組化試劑盒以及兔抗鼠VEGF抗體；英國abcam公司小鼠抗PEDF及兔抗VEGF單克隆抗體等。

1.2 動物分組及造模 選擇健康雄性遠交群SD大鼠120只，周齡8～11周，體質(zhì)量180～200 g，動物合格證號：syxk(鄂)2011-0031。入選大鼠先行1周飼養(yǎng)，自由進食飲水，隨后按照隨機數(shù)字表格法分成正常對照組與糖尿病組，每組60只。糖尿病組大鼠按照一次性腹腔注射鏈脲質(zhì)菌素制作糖尿病模型[7]。

1.3 透射電鏡觀察大鼠視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu) 成模后1,3,5個月每組各隨機選取大鼠2只，麻醉處理后摘取眼球，在顯微鏡下順沿角膜邊緣剪開眼球，去除玻璃體，將含有視網(wǎng)膜的眼杯放入2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃下固定下4 h，取出眼杯使用磷酸鹽緩沖液沖洗，隨后經(jīng)四氧化鋨固定2 h，再應(yīng)用PBS緩沖液沖洗，丙醇與乙醇梯度脫水，再采用環(huán)氧樹脂進行浸透包埋，最后制成超薄的切片，應(yīng)用透射電鏡觀察。

1.4 視網(wǎng)膜EB含量檢測 成模后1，3，5個月每組各選取大鼠3只，麻醉處理后，從右頸靜脈注入50 mg/kg的EB溶液，經(jīng)2 h的循環(huán)后(為了維持大鼠生命體征可行氣管插管)，打開大鼠胸腔暴露其心臟，從左心室灌注多聚甲醛并循環(huán)3 min后摘取眼球，于顯微鏡下小心取出視網(wǎng)膜，過夜晾干后使用電子秤稱量其質(zhì)量。隨后與甲酰胺150 μL在70 ℃下孵育18 h。經(jīng)高速離心處理約1 h，再取其上清液，使用酶標(biāo)儀測定吸光度值及標(biāo)準化的EB含量。

1.5 視網(wǎng)膜VEGF、PEDF免疫組織化學(xué)染色 成模后1，3，5個月每組各選取大鼠4只，麻醉處理后，于顯微鏡下去除玻璃體，將含有視網(wǎng)膜的眼杯放入10%福爾馬林溶液中固定24 h，取結(jié)構(gòu)完整的視網(wǎng)膜切片，常規(guī)脫蠟，滴入枸鹽酸緩沖液，使用PBS洗滌處理，在室溫下孵育10 min，室溫下封閉處理15 min，再滴加兔抗鼠抗體，4 ℃下過夜。脫水處理后封片，隨后使用圖像處理分析軟件觀察染色區(qū)的光密度值。

1.6 Western-blot法檢測視網(wǎng)膜 VEGF、PEDF 含量 成模后1，3，5個月每組各隨機選樣大鼠4只，麻醉后處死，取其眼球，在顯微鏡觀察下去除玻璃體，小心分離視網(wǎng)膜，于-80 ℃下液氮冷凍保存；提取視網(wǎng)膜總蛋白，將視網(wǎng)膜組織放置于10倍體積的組織裂解液中勻漿，勻漿徹底后將其轉(zhuǎn)移至離心管中離心20 min，取其上清液保存于-20 ℃下。將視網(wǎng)膜蛋白上清液提取后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定所選樣品的蛋白總含量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu) 正常對照組大鼠的視網(wǎng)膜細胞基底膜完整，且有連續(xù)性，膜盤結(jié)構(gòu)清楚，外核以及內(nèi)核層的細胞核染色質(zhì)均勻，神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)豐富，細胞核較大且明顯，同時表面可見突起，見圖1。成模后1個月，糖尿病組大鼠的視網(wǎng)膜色素上皮細胞胞質(zhì)出現(xiàn)線粒體空泡，部分膜盤出現(xiàn)模糊，間隙大，外核與內(nèi)核層細胞排列規(guī)則，染色質(zhì)有輕微密集，細胞胞質(zhì)較豐富，出現(xiàn)少量線粒體空泡變性，見圖2。成模后3個月，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜基底膜有不連續(xù)現(xiàn)象，且增厚，內(nèi)皮細胞有增生，間隙大，出現(xiàn)空泡樣，部分已經(jīng)溶解且斷裂，外核層細胞核染色質(zhì)及細胞排列均不規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細胞線粒體腫脹同時有空泡樣改變，見圖3。成模后5個月，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜基底膜連續(xù)性較差，內(nèi)皮細胞突起，吞飲泡明顯增多，膜盤大量溶解或者斷裂，外核與內(nèi)核層細胞排列紊亂，神經(jīng)節(jié)細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，有線粒體腫脹，細胞核核膜消失或者表現(xiàn)核固縮，見圖4。

2.2 大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài) 正常對照組大鼠視網(wǎng)膜血管管徑粗細均勻，走行較規(guī)則，無熒光滲漏，見圖5；成模后1個月糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜血管血管管徑粗細均勻，走行也相對規(guī)則，無明顯熒光滲漏，見圖6；成模后3個月糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜血管管徑粗細不均，走行迂曲，有少量熒光滲漏，見圖7；成模后5個月糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜血管已經(jīng)出現(xiàn)病理改變，血管迂曲十分明顯，走行紊亂，管徑粗細不均，大量的熒光滲漏，見圖8。

圖1 正常對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)

圖2 成模后1個月糖尿組組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)

圖3 成模后3個月糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)

圖4 成模后5個月糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)

2.3 不同病程階段糖尿病大鼠視網(wǎng)膜EB含量 伴隨病程的進展，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜EB含量均有所增加(P均<0.05),且均高于正常對照組(P均<0.05)。見表1。

圖5 正常對照組大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)

圖6 成模后1個月糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜血管

圖7 成模后3個月糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)

圖8 成模后5個月糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)

表1 不同病程階段大鼠視網(wǎng)膜EB含量

注：①與正常對照組比較，P<0.05;②與1個月時比較，P<0.05;③與3個月時比較，P<0.05。

2.4 大鼠視網(wǎng)膜VEGF、PEDF表達情況 視網(wǎng)膜中的VEGF、PEDF陽性表達為黃褐色。正常對照組中VEGF主要分布在神經(jīng)節(jié)的細胞層面，在內(nèi)核當(dāng)中也有一定量的表達，表現(xiàn)為弱陽性。糖尿病組伴隨病程延長，VEGF陽性表達出現(xiàn)明顯增強現(xiàn)象，成模1個月后，VEGF在內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層均有一定表達；成模3個月后，VEGF在外核層有一定量的表達，成模5個月后，幾乎在視網(wǎng)膜的各個層面均有VEGF表達。正常對照組中PEDF呈強陽性反應(yīng)，在視網(wǎng)膜的各層面都有表達。糖尿病組成模1個月后，PEDF在大鼠視網(wǎng)膜的內(nèi)叢狀層、內(nèi)核以及外核層、神經(jīng)節(jié)細胞層等均有表達；成模3個月后，PEDF在內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層中有表達；成模5個月后，PEDF僅在視網(wǎng)膜的內(nèi)叢狀層及神經(jīng)節(jié)細胞層面有所表達。伴隨病程的進展，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中VEGF 蛋白表達量明顯增加(P均<0.05)，PEDF 蛋白表達量顯著減少(P均<0.05),與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 不同病程階段大鼠視網(wǎng)膜VEGF、PEDF蛋白表達光密度值比較

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與1個月時比較，P<0.05；③與3個月時比較，P<0.05。

3 討 論

DR視網(wǎng)膜病變的主要病理變化包括視網(wǎng)膜功能及形態(tài)學(xué)的改變。過去一直認為DR的早期病變主要表現(xiàn)為糖尿病中后期的視網(wǎng)膜微血管病變，但近年來的研究表明，早期的糖尿病階段，視網(wǎng)膜就已經(jīng)出現(xiàn)了病理性改變，感光細胞出現(xiàn)水腫及退行性變；在整個病程的發(fā)展早期，神經(jīng)節(jié)細胞核膜已經(jīng)消失，同時細胞胞體也已經(jīng)變形，可見光感受器細胞數(shù)目有所減少，內(nèi)皮細胞腫脹[8]。本實驗結(jié)果顯示，糖尿病發(fā)生1個月時，大鼠的視網(wǎng)膜膜盤、色素上皮細胞、內(nèi)核以及外核層細胞以及神經(jīng)節(jié)細胞結(jié)構(gòu)都出現(xiàn)了病理變化，且伴隨病程進展，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞的超微結(jié)構(gòu)病理變化也隨之加重，發(fā)展至5個月時，視網(wǎng)膜細胞超微結(jié)構(gòu)的病理變化已經(jīng)十分嚴重。

目前研究視網(wǎng)膜病的發(fā)病機制，從而來防治糖尿病視網(wǎng)膜病已經(jīng)成為當(dāng)前的熱點和主題。研究發(fā)現(xiàn)造成糖尿病視網(wǎng)膜病的主要因素是視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)病變，而對于可否維持視網(wǎng)膜正常功能及結(jié)構(gòu)，維持新生血管形成及視網(wǎng)膜血管通透性，VEGF 與 PEDF 的平衡狀態(tài)則起到了重要作用[9]。VEGF會造成血管內(nèi)皮細胞的遷移與增殖，PEDF會對這一過程產(chǎn)生抑制，提示PEDF下降為DR發(fā)病的重要因素。PEDF因子屬于內(nèi)源性抗炎因子，在DR中，其表達水平的降低也是導(dǎo)致血管滲漏以及炎癥產(chǎn)生的主要因素，PEDF會對MCP-1等炎性因子產(chǎn)生抑制，這說明PEDF是通過抑制炎性因子而起到保護DR的作用[10]。另外，PEDF因子具有較強的抗氧化性，能夠與谷胱甘肽過氧化物酶作用并抑制其所誘發(fā)的細胞損害，從而與過氧化物對抗，防止其誘發(fā)細胞凋亡以及細胞功能障礙；同時PEDF因子可以增加細胞胞質(zhì)的緊密粘連蛋白的進一步表達[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞中的VEGF 與 PEDF表達嚴重失調(diào)，表現(xiàn)為VEGF增加而PEDF明顯減少。且在糖尿病初期，VEGF、PEDF 表達失衡就已經(jīng)存在，并且會隨著病程的進展而表現(xiàn)為VEGF表達逐漸增多，而PEDF 表達逐漸降低，二者的這種失衡狀態(tài)存在于整個病變的發(fā)生發(fā)展過程中，提示對二者進行有效調(diào)節(jié)使其達到平衡狀態(tài)是治療DR的關(guān)鍵，這為該病臨床治療方案的制訂奠定了基礎(chǔ)。

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Significance of VEGF, PEDF expression in retinal pathological changes of different course of diabetic rats

LI Ruhua, YU Jinqiang

(The People’s Hospital Affiliated to Hubei Medical University, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to observe the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and pigment epithelium-derived factor (PEDF) in the retina of different course of diabetic rats.Methods 120 cases of male outbred rats (SD rats) were selected to divide into the normal control group and diabetes group according to the random number table method as 60 cases in each. The diabetic rat model was made by intraperitoneal injection of streptozotocin method. After 1, 3, and 5 month, the retinal pathological changes were observed by transmission electron microscope and retinal EB content determination method respectively, and the expression of VEGF and PEDF in the retina of diabetic rats were observed by Western-blot technology and immunohistochemical methods. Results The EB staining showed of the retinal vessels morphology in rats of normal control group was good, the retinal vessels was regular in the first month, and they was tortuose with some changes in the third month; After modeling success in the fifth month, the tortuosity had been very clear, and go for irregular with uneven thickness of vascular. At the same time, the EB content in rats of diabetic group in the 1st, 2nd, and 3rd month after modeling successful were significantly higher than that of normal control group (allP<0.05), and content was increased with the progress of the disease. Immunohistochemistry showed, the positive staining of VEGF in diabetic rats was increased with disease progression, the value of optical density was increased; the positive staining of PEDF was increased with the progress of the disease and weakened, and the value of optical density was decreased. There were significant differences between the control group and diabetic group (allP<0.05). Western-blot assay showed that the retinal VEGF protein content in each stage of diabetic group were increased with the progress of the disease, and the PEDF protein were decreased, there was significant difference between control group and diabetic group (P<0.05). The structure of retinal cells in DM1 group rats had changed, and these changes will be aggravated with the progression of course of disease. Conclusion The earliest observable retinopathy is retinal cell ultrastructure pathological changes, will increase with the progress of the disease; retinal vascular morphology of late in the illness will change, and increased with the severity of illness; In the early days, VEGF and PEDF in retinal expression has imbalance, and with the progress of the disease, the expression of VEGF is increased, PEDF expression is decreased, the imbalance of them is throughout the development process of disease.

diabetic retinopathy; vascular endothelial growth factor; pigment epithelium derived factor

李儒華，男，主治醫(yī)師，主要從事角膜病、白內(nèi)障、眼底病等研究。

余錦強，E-mail:yujinqiang365@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.009

R-332

A

1008-8849(2015)21-2307-04

2015-01-15