胡 潔 唐岳鵬 黃桂林

·實驗研究·

主導管損傷后SD大鼠下頜下腺的組織學觀察

胡 潔 唐岳鵬 黃桂林

目的 建立主導管損傷的SD 大鼠模型，觀察主導管損傷后腺體的組織學變化。方法 選取8只雄性SD大鼠，構建SD大鼠主導管損傷模型，6 d后摘除大鼠的腺體組織進行免疫組織化學染色,觀察腺體組織變化。結果 主導管結扎后第6天，腺泡結構消失，腺小葉輪廓清楚。腺泡細胞重組形成管樣結構；Ki-67陽性率為74.5%，在重組區(qū)域和導管基膜區(qū)層粘連蛋白(LN)、整合素α6β1和CD90.1表達。結論 主導管損傷能促使下頜下腺干/祖細胞開始表達這些潛在特性并分化為腺泡細胞。

下頜下腺；損傷；干/祖細胞；組織學

正常狀態(tài)下，成熟個體組織中的干細胞很少。組織損傷后，成體干細胞能增殖分化修復損傷組織。本文通過結扎下頜下腺主導管，構建下頜下腺損傷模型，觀察下頜下腺具有干/祖細胞特征細胞的增殖和功能變化。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性SD大鼠8只，體重180～200 g，SPF級。一抗：小鼠抗大鼠整合素α6β1單克隆抗體；小鼠抗人淀粉酶單克隆抗體；兔抗小鼠/大鼠CD90.1單克隆抗體；兔抗大鼠LN多克隆抗體、兔抗大鼠Ki-67多克隆抗體。二抗：Envision兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒，DAB顯色試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 8只雄性SD大鼠，采用10%水合氯醛在大鼠腹腔內進行注射麻醉。麻醉生效后，大鼠固定為仰臥位，拉伸頸部固定于動物架上；備皮、消毒，鋪巾，沿頸中線切開；解剖分離雙側下頜下腺主導管；隨機雙重結扎一側下頜下腺主導管，另一側作為正常對照；分層縫合關閉創(chuàng)面。術后預防感染，6 d后無菌條件下摘除腺體。將摘除的腺體組織進行免疫組織化學染色。

1.2.2 免疫組化染色采用兩步法，按試劑盒使用說明進行操作。

2 結果

主導管結扎6 d后，下頜下腺腺體減小。腺泡正常結構消失，腺小葉輪廓清楚。腺泡細胞重組形成管樣結構，大小不等；部分構成管樣結構的腺泡細胞細胞核排列整齊，遠離基底膜區(qū)，胞漿成分減少；管樣結構周圍有包膜形成。梭形樣細胞包繞在管樣結構的基底膜區(qū)，胞核扁長。Ki-67免疫組織化學染色可見由腺泡細胞重組形成導管的細胞核呈棕褐色，胞漿棕黃色。Ki-67陽性率約為74.5%。LN免疫組織化學染色可見在間質和重組的導管細胞基底膜處胞漿棕黃色,陽性細胞環(huán)繞管樣結構。CD90.1免疫組織化學染色可見在腺泡結構消失區(qū)域較多的細胞胞漿深染，胞漿呈棕黃色。腺泡細胞重組形成的管樣結構中部分細胞胞漿深染。腺體導管細胞未見深染。Amylase免疫組織化學染色可見較多的細胞胞漿深染，胞漿呈棕黃色。腺體導管腔面及附近的細胞胞漿深染。α6β1免疫組織化學染色可見在腺泡細胞重組的管樣結構中細胞胞漿深染。腺體導管及附近細胞胞漿深染。

對照側腺體間質，腺泡細胞及導管細胞Ki-67陽性率＜1%。LN、α6β1和CD90.1免疫組織化學染色時，在腺體間質和導管細胞基底膜區(qū)有少數細胞胞漿呈棕黃色，顏色較淺。腺泡細胞及導管細胞未見表達。Amylase免疫組織化學染色時,腺泡細胞胞漿呈淡黃色至棕黃色顆粒狀著色。導管細胞胞漿淡染。

3 討論

Ki-67作為評價細胞增殖的指標，已廣泛用于基礎和臨床研究。本實驗中，主導管結扎的下頜下腺組織中，大量的腺泡細胞和導管細胞胞核呈棕褐色，Ki-67陽性率為74.5%。對照側下頜下腺偶見單個細胞核呈棕褐色。主導管結扎后下頜下腺組織中細胞增殖活躍。

在嚙齒動物涎腺發(fā)育過程中，涎腺上皮細胞胞漿中存在LN，胚胎期后逐漸消失，成年后胞漿中不再表達LN［1］。LN的表達體現了細胞的增殖分化能力。含β1亞基的整合素在細胞的增殖和分化中發(fā)揮著重要作用，胚胎鼠下頜下腺上皮細胞表達α6整合素。用免疫磁珠分選方法在SD大鼠下頜下腺細胞中分選出的α6β1整合素陽性細胞，在體外培養(yǎng)時具有較高的增殖能力和克隆形成能力。因此，有學者認為，α6β1和LN雙陽性細胞是SD大鼠下頜下腺干/祖細胞的典型特征之一［2,3］。本實驗發(fā)現，主導管結扎6 d后，在腺泡結構消失區(qū)域可見較多的細胞強陽性表達α6β1、LN表達。表明組織損傷模型能激活α6β1及LN陽性細胞，促使其增殖。人胚胎下頜下腺細胞干/祖細胞CD90.1 表達率為99.69%［4］。主導管結扎后，腺泡細胞及導管附近的細胞CD90.1陽性表達，陽性細胞呈叢狀分布。組織損傷模型激活CD90.1陽性細胞，促使其增殖。LN、α6β1和CD90.1陽性表達細胞在對照組腺體組織中位于間質和導管細胞基底膜區(qū)，表明下頜下腺成體干/祖細胞位于該區(qū)域；主導管結扎后在腺泡細胞重組的管樣結構及基底膜區(qū)陽性表達，表明受到損傷刺激后，下頜下腺干/祖細胞在這一區(qū)域增殖活躍。

在正常涎腺組織中，只有腺泡細胞的分泌顆粒中存在Amylase，導管系統(tǒng)細胞中無Amylase。主導管結扎后腺泡細胞及導管細胞中均可見到Amylase陽性表達。腺泡細胞中Amylase表達、深染可能是由于導管結扎后，腺泡細胞功能未完全消失，胞漿比例減少，細胞中分泌顆粒未排出；導管及其附近的細胞中存在Amylase，提示這些細胞具有腺泡細胞的分泌功能，具有在體內向成熟腺泡細胞分化的潛能。

綜上所述，導管損傷能促使下頜下腺干/祖細胞開始表達這些潛在特性并分化為腺泡細胞。

［1］ 黃桂林，姜群，王天果，等.損傷下頜下腺模型中涎腺干/祖細胞分離及特征的初步研究.實用口腔醫(yī)學雜志，2009，25(2): 174-177.

［2］ 蔣練，黃桂林，姜群，等.腺體組織損傷后體外分離下頜下腺干/祖細胞后的克隆化培養(yǎng).中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(49):9765-9768.

［3］ 潘光華，陳偉，張霓霓，等.SD大鼠下頜下腺主導管結扎損傷及再通后的組織學觀察.實用口腔醫(yī)學雜志，2012，28(5):570-573.

［4］ 王春宇，黃桂林，張霓霓，等.人下頜下腺干/祖細胞的分離及培養(yǎng) .中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(45):8464-8468.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.29.211

2015-06-10］

湖南省教育廳2012年度科學研究項目(項目編號：12C1248)

425106 湖南省永州職業(yè)技術學院醫(yī)學校區(qū)(胡潔唐岳鵬)；貴州省遵義醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科(黃桂林)通訊作者：黃桂林