胡 潔 唐岳鵬 黃桂林

·實驗研究·

主導(dǎo)管損傷后SD大鼠下頜下腺的組織學(xué)觀察

胡 潔 唐岳鵬 黃桂林

目的 建立主導(dǎo)管損傷的SD 大鼠模型，觀察主導(dǎo)管損傷后腺體的組織學(xué)變化。方法 選取8只雄性SD大鼠，構(gòu)建SD大鼠主導(dǎo)管損傷模型，6 d后摘除大鼠的腺體組織進行免疫組織化學(xué)染色,觀察腺體組織變化。結(jié)果 主導(dǎo)管結(jié)扎后第6天，腺泡結(jié)構(gòu)消失，腺小葉輪廓清楚。腺泡細胞重組形成管樣結(jié)構(gòu)；Ki-67陽性率為74.5%，在重組區(qū)域和導(dǎo)管基膜區(qū)層粘連蛋白(LN)、整合素α6β1和CD90.1表達。結(jié)論 主導(dǎo)管損傷能促使下頜下腺干/祖細胞開始表達這些潛在特性并分化為腺泡細胞。

下頜下腺；損傷；干/祖細胞；組織學(xué)

正常狀態(tài)下，成熟個體組織中的干細胞很少。組織損傷后，成體干細胞能增殖分化修復(fù)損傷組織。本文通過結(jié)扎下頜下腺主導(dǎo)管，構(gòu)建下頜下腺損傷模型，觀察下頜下腺具有干/祖細胞特征細胞的增殖和功能變化。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性SD大鼠8只，體重180～200 g，SPF級。一抗：小鼠抗大鼠整合素α6β1單克隆抗體；小鼠抗人淀粉酶單克隆抗體；兔抗小鼠/大鼠CD90.1單克隆抗體；兔抗大鼠LN多克隆抗體、兔抗大鼠Ki-67多克隆抗體。二抗：Envision兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒，DAB顯色試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 8只雄性SD大鼠，采用10%水合氯醛在大鼠腹腔內(nèi)進行注射麻醉。麻醉生效后，大鼠固定為仰臥位，拉伸頸部固定于動物架上；備皮、消毒，鋪巾，沿頸中線切開；解剖分離雙側(cè)下頜下腺主導(dǎo)管；隨機雙重結(jié)扎一側(cè)下頜下腺主導(dǎo)管，另一側(cè)作為正常對照；分層縫合關(guān)閉創(chuàng)面。術(shù)后預(yù)防感染，6 d后無菌條件下摘除腺體。將摘除的腺體組織進行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.2 免疫組化染色采用兩步法，按試劑盒使用說明進行操作。

2 結(jié)果

主導(dǎo)管結(jié)扎6 d后，下頜下腺腺體減小。腺泡正常結(jié)構(gòu)消失，腺小葉輪廓清楚。腺泡細胞重組形成管樣結(jié)構(gòu)，大小不等；部分構(gòu)成管樣結(jié)構(gòu)的腺泡細胞細胞核排列整齊，遠離基底膜區(qū)，胞漿成分減少；管樣結(jié)構(gòu)周圍有包膜形成。梭形樣細胞包繞在管樣結(jié)構(gòu)的基底膜區(qū)，胞核扁長。Ki-67免疫組織化學(xué)染色可見由腺泡細胞重組形成導(dǎo)管的細胞核呈棕褐色，胞漿棕黃色。Ki-67陽性率約為74.5%。LN免疫組織化學(xué)染色可見在間質(zhì)和重組的導(dǎo)管細胞基底膜處胞漿棕黃色,陽性細胞環(huán)繞管樣結(jié)構(gòu)。CD90.1免疫組織化學(xué)染色可見在腺泡結(jié)構(gòu)消失區(qū)域較多的細胞胞漿深染，胞漿呈棕黃色。腺泡細胞重組形成的管樣結(jié)構(gòu)中部分細胞胞漿深染。腺體導(dǎo)管細胞未見深染。Amylase免疫組織化學(xué)染色可見較多的細胞胞漿深染，胞漿呈棕黃色。腺體導(dǎo)管腔面及附近的細胞胞漿深染。α6β1免疫組織化學(xué)染色可見在腺泡細胞重組的管樣結(jié)構(gòu)中細胞胞漿深染。腺體導(dǎo)管及附近細胞胞漿深染。

對照側(cè)腺體間質(zhì)，腺泡細胞及導(dǎo)管細胞Ki-67陽性率＜1%。LN、α6β1和CD90.1免疫組織化學(xué)染色時，在腺體間質(zhì)和導(dǎo)管細胞基底膜區(qū)有少數(shù)細胞胞漿呈棕黃色，顏色較淺。腺泡細胞及導(dǎo)管細胞未見表達。Amylase免疫組織化學(xué)染色時,腺泡細胞胞漿呈淡黃色至棕黃色顆粒狀著色。導(dǎo)管細胞胞漿淡染。

3 討論

Ki-67作為評價細胞增殖的指標，已廣泛用于基礎(chǔ)和臨床研究。本實驗中，主導(dǎo)管結(jié)扎的下頜下腺組織中，大量的腺泡細胞和導(dǎo)管細胞胞核呈棕褐色，Ki-67陽性率為74.5%。對照側(cè)下頜下腺偶見單個細胞核呈棕褐色。主導(dǎo)管結(jié)扎后下頜下腺組織中細胞增殖活躍。

在嚙齒動物涎腺發(fā)育過程中，涎腺上皮細胞胞漿中存在LN，胚胎期后逐漸消失，成年后胞漿中不再表達LN［1］。LN的表達體現(xiàn)了細胞的增殖分化能力。含β1亞基的整合素在細胞的增殖和分化中發(fā)揮著重要作用，胚胎鼠下頜下腺上皮細胞表達α6整合素。用免疫磁珠分選方法在SD大鼠下頜下腺細胞中分選出的α6β1整合素陽性細胞，在體外培養(yǎng)時具有較高的增殖能力和克隆形成能力。因此，有學(xué)者認為，α6β1和LN雙陽性細胞是SD大鼠下頜下腺干/祖細胞的典型特征之一［2,3］。本實驗發(fā)現(xiàn)，主導(dǎo)管結(jié)扎6 d后，在腺泡結(jié)構(gòu)消失區(qū)域可見較多的細胞強陽性表達α6β1、LN表達。表明組織損傷模型能激活α6β1及LN陽性細胞，促使其增殖。人胚胎下頜下腺細胞干/祖細胞CD90.1 表達率為99.69%［4］。主導(dǎo)管結(jié)扎后，腺泡細胞及導(dǎo)管附近的細胞CD90.1陽性表達，陽性細胞呈叢狀分布。組織損傷模型激活CD90.1陽性細胞，促使其增殖。LN、α6β1和CD90.1陽性表達細胞在對照組腺體組織中位于間質(zhì)和導(dǎo)管細胞基底膜區(qū)，表明下頜下腺成體干/祖細胞位于該區(qū)域；主導(dǎo)管結(jié)扎后在腺泡細胞重組的管樣結(jié)構(gòu)及基底膜區(qū)陽性表達，表明受到損傷刺激后，下頜下腺干/祖細胞在這一區(qū)域增殖活躍。

在正常涎腺組織中，只有腺泡細胞的分泌顆粒中存在Amylase，導(dǎo)管系統(tǒng)細胞中無Amylase。主導(dǎo)管結(jié)扎后腺泡細胞及導(dǎo)管細胞中均可見到Amylase陽性表達。腺泡細胞中Amylase表達、深染可能是由于導(dǎo)管結(jié)扎后，腺泡細胞功能未完全消失，胞漿比例減少，細胞中分泌顆粒未排出；導(dǎo)管及其附近的細胞中存在Amylase，提示這些細胞具有腺泡細胞的分泌功能，具有在體內(nèi)向成熟腺泡細胞分化的潛能。

綜上所述，導(dǎo)管損傷能促使下頜下腺干/祖細胞開始表達這些潛在特性并分化為腺泡細胞。

［1］ 黃桂林，姜群，王天果，等.損傷下頜下腺模型中涎腺干/祖細胞分離及特征的初步研究.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(2): 174-177.

［2］ 蔣練，黃桂林，姜群，等.腺體組織損傷后體外分離下頜下腺干/祖細胞后的克隆化培養(yǎng).中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(49):9765-9768.

［3］ 潘光華，陳偉，張霓霓，等.SD大鼠下頜下腺主導(dǎo)管結(jié)扎損傷及再通后的組織學(xué)觀察.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，28(5):570-573.

［4］ 王春宇，黃桂林，張霓霓，等.人下頜下腺干/祖細胞的分離及培養(yǎng) .中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(45):8464-8468.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.29.211

2015-06-10］

湖南省教育廳2012年度科學(xué)研究項目(項目編號：12C1248)

425106 湖南省永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)校區(qū)(胡潔唐岳鵬)；貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科(黃桂林)通訊作者：黃桂林