趙秋霞 陰懷清

2014年山西運(yùn)城臨床患者乙型腦炎病毒E分子生物學(xué)特征及基因分型研究

趙秋霞 陰懷清

目的 初步了解2014年山西省運(yùn)城地區(qū)病毒性腦炎患者中乙型腦炎病毒E基因分子生物學(xué)特征和基因型別分布特征。方法 采集19例臨床診斷為病毒性腦炎患者的腦脊液標(biāo)本, 提取核酸通過巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nPCR)擴(kuò)增乙型腦炎病毒基因片斷, 采用生物信息學(xué)軟件對(duì)病毒E基因區(qū)段核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分子生物學(xué)特征分析并與通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹與國內(nèi)外不同年代和地域分離的覆蓋5個(gè)基因型別的乙型腦炎病毒進(jìn)行基因型別研究。結(jié)果 19例山西運(yùn)城腦炎患者標(biāo)本中有2例為乙型腦炎病毒核酸陽性, 基因分型結(jié)果顯示均為基因Ⅰ型乙型腦炎病毒。結(jié)論 2014年山西運(yùn)城地區(qū)病毒性腦炎患者中乙型腦炎病毒為基因Ⅰ型, 與毒力相關(guān)的8個(gè)位點(diǎn)與乙型腦炎病毒P3一致, 沒有發(fā)生突變, 不會(huì)影響病毒毒力。理論上表明, 目前使用的乙型腦炎病毒疫苗對(duì)當(dāng)?shù)氐囊倚湍X炎病毒仍具有保護(hù)力。

蟲媒病毒；乙型腦炎病毒；序列分析；種系發(fā)生

流行性乙型腦炎又稱為日本腦炎(JE), 是由攜帶乙型腦炎病毒的節(jié)肢動(dòng)物通過叮咬人畜傳播造成的傳染性疾病。乙型腦炎首次于1924年在日本報(bào)道, 此后相繼在亞洲以及南太平洋地區(qū)傳播流行。近年來乙型腦炎不斷發(fā)生爆發(fā)式流行,我國最近的一次乙型腦炎病毒大流行發(fā)生在2006年［1］, 山西運(yùn)城地區(qū)發(fā)生乙型腦炎80余例, 死亡20余人。乙型腦炎已經(jīng)成為引起全世界關(guān)注的重要的公共衛(wèi)生問題。

乙型腦炎的病原體為乙型腦炎病毒(JEV), 屬于黃病毒科, 黃病毒屬?；蚪M為11 kb的單股正鏈RNA, 可編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：C、M、E, 與病毒致病性和免疫原性重要相關(guān)。編碼7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5。根據(jù)基因組中編碼E蛋白的核苷酸的差異, 將乙型腦炎分為5個(gè)基因型, 分別為基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型。乙型腦炎是一種疫苗可預(yù)防性疾病, 我國目前使用的乙型腦炎疫苗株P(guān)3株和Sa14-14-2株, 此兩株病毒株均為基因Ⅲ型乙型腦炎毒株。根據(jù)最新的乙型腦炎病毒分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示［2,3］, 目前流行的乙型腦炎病毒優(yōu)勢(shì)基因型別已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)化, 由基因Ⅲ型轉(zhuǎn)化為基因Ⅰ型［4,5］。有文獻(xiàn)報(bào)道,臨床出現(xiàn)接種乙型腦炎疫苗后仍感染乙型腦炎病毒的病例,經(jīng)分子基因特征分析為基因Ⅰ型乙型腦炎病毒感染［6］。因此,開展運(yùn)城地區(qū)乙型腦炎病毒基因分型和分子特征研究對(duì)于明確運(yùn)城地區(qū)流行的乙型腦炎病毒基因型別, 了解運(yùn)城乙型腦炎病毒的分子進(jìn)化特征, 評(píng)估目前使用的乙型腦炎病毒疫苗的免疫保護(hù)力的研究具有重要意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2014年6～10月, 收集到運(yùn)城市中心醫(yī)院臨床診斷為病毒性腦炎患者的腦脊液標(biāo)本19份。

1.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(美國QIAGEN公司) 提取患者腦脊液標(biāo)本中病毒的總RNA, 采用Amersham Bioscience Ready-to-GoTM You First-Strand Beads (美國Amersham Pharmacia Biotech)制備cDNA。取2 μl cDNA做反應(yīng)模板, 采用巢樣PCR方法進(jìn)行乙型腦炎病毒特異性核酸檢測(cè), 引物如下： PEf:ACGTTCTTCAAGTTTACAGCA; PEr：GGAAATGAAGGCTCAATCATGTG；PEfn：GATGTCAATGGC ACATCCAGT; PErn：CGTTCTTCAAGTTTACAGCATTAGC。先依次加入10×Buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTP 5 μl、上下游引物各1 μl、exTaq酶0.75 μl、去離子31.75 μl, 充分混勻, 94℃預(yù)變性5 min, 94℃30 sec, 55℃30 sec, 72℃1.5 min, 30個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min, 1%瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增條帶, 用TaKaRa DNA fragment Purification Kit純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 送上海生工生物公司測(cè)序。

1.3 病毒序列分析 本次實(shí)驗(yàn)從GenBank中選取覆蓋全部5個(gè)基因型別的49株乙型腦炎病毒的E基因序列為對(duì)照進(jìn)行序列及進(jìn)化分析。采用Clustal X(1.83)軟件進(jìn)行序列聯(lián)配分析, BioEdit軟件進(jìn)行序列編輯, 采用DNASTAR軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸差異度分析, MEGA6完成病毒進(jìn)化分析, 氨基酸位點(diǎn)對(duì)比分析由GENEDOC(3.2)軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 患者標(biāo)本的分子生物學(xué)檢測(cè) 從19例患者腦脊液標(biāo)本中提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄成為病毒基因組cDNA, 采用乙型腦炎病毒E基因的巢式擴(kuò)增引物, 19份標(biāo)本中有2份標(biāo)本為乙型腦炎病毒核酸陽性病例, 陽性率10.5%。

2.2 山西運(yùn)城乙型腦炎病毒的基因分型研究 從NCBI的GenBank中選擇分離自不同地區(qū), 不同時(shí)間, 不同宿主, 覆蓋全部5個(gè)基因型別的乙型腦炎病毒病毒序列總計(jì)49株, 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹進(jìn)行基于乙型腦炎病毒E基因的分型研究。結(jié)果顯示：2014年從山西運(yùn)城地區(qū)腦炎患者標(biāo)本中擴(kuò)增的2株乙型腦炎病毒病毒株SX1401和SX1402均屬于基因型Ⅰ型, 這2株病毒聚類成一個(gè)小的分支表現(xiàn)出一定的地域分布特征。

2.3 山西運(yùn)城乙型腦炎病毒E基因核苷酸序列特征 采用WHO推薦并在中國廣泛使用的減毒活疫苗株SA14-14-2和P3為對(duì)照, 對(duì)山西運(yùn)城地區(qū)病毒性腦炎患者標(biāo)本擴(kuò)增的2株乙型腦炎病毒E基因區(qū)段進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的同源性分析, 結(jié)果如下：新分離的2株乙型腦炎病毒之間核苷酸和氨基酸同源性為100%；與疫苗株P(guān)3和SA14-14-2之間核苷酸同源性分別為87.4%和87.5%, 氨基酸同源性均為97.2%。乙型腦炎病毒E蛋白、囊膜糖蛋白為主要的結(jié)構(gòu)蛋白,影響病毒毒力、入侵和免疫原性。分子量約為53 kDa, 含500個(gè)氨基酸殘基。將運(yùn)城地區(qū)新分離病毒與乙型腦炎病毒疫苗株SA14-14-2和P3的E蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),分別存在13個(gè)和10個(gè)基酸差異位點(diǎn)。乙型腦炎病毒E蛋白中的一些位點(diǎn)E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315、E439是影響乙型腦炎病毒毒力的關(guān)鍵位點(diǎn), 運(yùn)城地區(qū)腦炎患者乙型腦炎病毒E基因序列與疫苗株P(guān)3相比8個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)均未發(fā)生改變。

3 討論

乙型腦炎病毒基因型別的分布具有比較明顯的地域分布傾向性, 其中基因Ⅰ型和Ⅲ型主要分布于溫帶和亞熱帶地區(qū),而Ⅱ型和Ⅳ型主要分布于熱帶地區(qū), 基因Ⅴ型乙型腦炎病毒是最古老的基因型別。最新的乙型腦炎病毒分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn), 基因Ⅰ型是最年輕的基因型別, 蘊(yùn)藏著豐富的相對(duì)種群多樣性, 在與基因Ⅲ型的競(jìng)爭(zhēng)中處于優(yōu)勢(shì)地位, 在乙型腦炎流行區(qū)呈現(xiàn)迅速擴(kuò)張趨勢(shì), 并逐漸替代原有基因型別病毒［4］。

山西省運(yùn)城市地處黃河沿岸, 是乙型腦炎流行的高發(fā)區(qū)。文獻(xiàn)報(bào)道［2］, 運(yùn)城地區(qū)1955～1997共發(fā)生乙型腦炎3341例, 死亡711例。2006年［1］, 運(yùn)城市發(fā)生80余例成人型病毒性腦炎爆發(fā)流行, 無論患者腦脊液或當(dāng)?shù)夭杉孟x標(biāo)本中均同時(shí)檢測(cè)到基因Ⅰ型和Ⅲ型乙型腦炎病毒。本次調(diào)查結(jié)果顯示, 在運(yùn)城19例病毒性腦炎標(biāo)本中檢測(cè)到2株基因Ⅰ型乙型腦炎病毒。提示, 該地區(qū)乙型腦炎病毒基因型別與亞洲其他地域一樣, 發(fā)生了由基因Ⅰ型向基因Ⅲ型別的轉(zhuǎn)換。

乙型腦炎屬于疫苗可預(yù)防性疾病, 由于乙型腦炎疫苗的廣泛應(yīng)用使得該病在我國已得到有效控制。20世紀(jì)60年代,中國使用1949年分離自腦炎患者乙型腦炎病毒毒株P(guān)3株研制出滅活疫苗, 一直沿用至今。20世紀(jì)90年代, 我國使用中國蚊蟲分離的乙型腦炎病毒(SA14株)培育出病毒減毒活疫苗(SA14-14-2株), 上述廣泛使用的乙型腦炎疫苗的病毒株均屬于基因Ⅲ型乙型腦炎病毒, 因此疫苗對(duì)不同基因型乙型腦炎病毒的免疫保護(hù)效果更是受到特別關(guān)注。乙型腦炎病毒E蛋白、囊膜糖蛋白為主要的結(jié)構(gòu)蛋白, 影響病毒毒力,病毒入侵和病毒的免疫原性, E蛋白有8個(gè)重要的氨基酸位點(diǎn)與病毒抗原性密切相關(guān)。運(yùn)城乙型腦炎病毒與疫苗P3株毒力相關(guān)的8個(gè)氨基酸位點(diǎn)沒有變異, 表明在當(dāng)?shù)啬壳暗囊倚湍X炎疫苗在理論上仍具有保護(hù)效力。

［1］ 尹遵棟, 梁曉峰, 李藝星, 等.運(yùn)城市2006年流行性乙型腦炎疫情調(diào)查分析.中國計(jì)劃免疫, 2007, 13(3):270-273.

［2］ 馬仙發(fā), 李宗民, 刑運(yùn)華, 等.運(yùn)城地區(qū)1955年至1997年流行性乙型腦炎流行病學(xué)分析.中華流行病學(xué)雜志, 1998(19):3-6.

［3］ Erlanger TE, Weiss S, Keiser J, et al.Past, present, and future of Japanese encephalitis.Emerg Infect Dis, 2009, 15(1):1-7.

［4］ van den Hurk AF, Ritchie SA, Mackenzie JS.Ecology and geographical expansion of Japanese encephalitis virus.Annual Review of Entomology , 2009(54):17-35.

［5］ Wang HY, Takasaki T, Fu SH, et al.Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China.Journal of General Virology, 2007, 88(Pt3):885-894.

［6］ Zhang JS, Zhao QM, Guo XF, et al.Isolation and genetic characteristics of human genotype 1 Japanese encephalitis virus, China, 2009.PLoS One, 2011, 6(1):e16418.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.24.017

2015-03-13］

030001 山西醫(yī)科大學(xué)(趙秋霞)；山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科(陰懷清)

陰懷清