張麗君

二惡英對內(nèi)膜組織中細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá)的影響

張麗君

目的 建立小鼠模型并探討二惡英對小鼠內(nèi)膜組織中細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá)的影響。方法 建立小鼠模型, 采用二惡英0、3、10 μg/kg對小鼠進(jìn)行宮內(nèi)、外暴露或?qū)m內(nèi)宮外聯(lián)合暴露,從而將小鼠模型分為五組：0-0組、3-0組、0-3組、3-3組和3-10組, 各有24只小鼠。采用免疫組織化學(xué)法檢測小鼠模型中子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞色素芳香化酶P450的表達(dá)水平。結(jié)果 細(xì)胞色素芳香化酶P450在小鼠暴露組的表達(dá)高于對照組(P＜0.05), 并隨二惡英暴露劑量的增加而升高(P＜0.05)。結(jié)論 二惡英可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜中細(xì)胞色素芳香化酶P450的表達(dá)。

二惡英；小鼠模型；細(xì)胞色素芳香化酶P450

二惡英是一種常見的環(huán)境污染物, 廣泛存在于人類生存環(huán)境中, 嚴(yán)重威脅人的身體健康。證據(jù)表明二惡英與婦科雌激素依賴性疾病的發(fā)病關(guān)系密切［1］, 細(xì)胞色素芳香化酶P450是合成雌激素的限速酶, 主要以合成雌激素而發(fā)揮作用。本研究建立小鼠模型, 使用不同劑量二惡英對其進(jìn)行宮內(nèi)、外暴露或聯(lián)合暴露, 檢測子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá)程度, 以探討二惡英對其表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物建模 參考Audrey M.Cummings1999年鋸齒類動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ浇！?0只SPF級C57BL/6雌鼠和30只SPF級C3H雄鼠在成熟期以2：1合籠, 將懷孕后的雌鼠隨機(jī)分為二惡英組40只和對照組20只。在妊娠的第8天通過給予暴露組口服二惡英類化合物TCDD 3 μg/kg, 母鼠產(chǎn)后共選擇雌性子鼠120只：在原對照組中選擇48只, 分為0 μg/kg和3 μg/kg組。在原暴露組中選擇72只, 分為0 μg/kg、3 μg/kg和10 ug/kg組。根據(jù)小鼠二惡英暴露時間及暴露劑量的不同將其分為五組, 0-0組, 3-0組, 0-3組, 3-3組, 3-10組, 每組含24只子鼠。在子鼠出生后第21天和49天給予0-3組、3-3組、3-10組二惡英類化合物各3 μg/kg, 3 μg/kg, 10 μg/kg,出生后第70天將全部小鼠處死, 取其子宮內(nèi)膜固定備用。

1.2 方法 使用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行連續(xù)切片, 常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)；封閉非特異性抗原30 min, 滴加鼠抗人P450單克隆抗體, 室溫孵育2.5 h, 用PBS沖洗3次, 二抗于室溫下孵育50 min, 后DAB顯色5 min, 清水沖洗終止反應(yīng), HE染色, 中性樹膠封片。這種抗體在腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞漿中表達(dá), 胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒沉著者即為陽性表達(dá)。

1.3 P450表達(dá) 免疫組化結(jié)果判斷細(xì)胞色素芳香化酶P450的表達(dá)是腺上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)有棕黃色的顆粒, 染色結(jié)果通過在光鏡下定位, 攝像系統(tǒng)攝取細(xì)胞圖像, 之后輸入醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理, 以平均光密度計(jì)算細(xì)胞色素芳香化酶P450的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

細(xì)胞色素芳香化酶P450蛋白位于暴露組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)。0-0組小鼠子宮內(nèi)膜中沒有細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá), 其余各組均有表達(dá), 3-0組(0.1453±0.0372), 0-3組(0.1729±0.0435), 3-3組(0.2349± 0.0593), 3-10組為(0.2756±0.0322), 其表達(dá)量按照0-0組、3-0組、0-3組、3-3組、3-10組的順序依次增加, 任意兩組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

二惡英主要產(chǎn)生于化工生產(chǎn)、汽車尾氣及城市廢棄物中, 可通過多種途徑進(jìn)入人體危害人的健康, 其主要方式是通過服用被二惡英污染的水、食物以及吸入含有二惡英類化合物的汽車尾氣。二惡英屬于劇毒化合物, 不能在人體中進(jìn)行對照研究。因此為了對其進(jìn)行研究分析, 需要建立動物模型。小鼠具有體型小、生長周期短、成熟早、飼養(yǎng)方便、繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn), 使用小鼠建立動物模型具有相對的優(yōu)越性。研究表明二惡英對哺乳類動物的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生危害［2］, 另有研究表明子宮內(nèi)膜不僅受到血液循環(huán)中雌激素的作用, 還能夠通過自分泌或者旁分泌的方式產(chǎn)生雌激素, 使局部雌激素分泌過多, 為雌激素依賴性疾病的發(fā)生創(chuàng)造了條件。細(xì)胞色素芳香化酶P450是合成雌激素的限速酶, 通過分泌雌激素對周圍組織產(chǎn)生作用, 本研究通過對小鼠子宮內(nèi)膜的檢測發(fā)現(xiàn), 細(xì)胞色素芳香化酶P450的表達(dá)量按0-0組, 3-0組, 0-3組, 3-3組和3-10組的順序依次增加。0-0組沒有細(xì)胞色素芳香化酶P450蛋白表達(dá), 3-0組小鼠即母體妊娠期暴露在二惡英中, 其子代小鼠內(nèi)膜中開始出現(xiàn)細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá), 說明妊娠期暴露促進(jìn)子代內(nèi)膜中雌激素的分泌, 導(dǎo)致子代患雌激素依賴性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。3-3組小鼠和3-0組相比, 子代二惡英暴露增加, 細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá)量也增加。說明細(xì)胞色素芳香化酶P450的表達(dá)隨著二惡英暴露時間的延長而增加, 同時也說明了宮內(nèi)宮外聯(lián)合暴露比單一宮內(nèi)暴露更能促進(jìn)細(xì)胞色素芳香化酶P450的表達(dá)。同樣, 3-3組小鼠和0-3組相比多了一次宮內(nèi)暴露, 內(nèi)膜中細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá)量也同時增多, 說明二惡英宮內(nèi)宮外聯(lián)合暴露比單一宮外暴露更能促進(jìn)細(xì)胞色素芳香化酶P450的表達(dá), 從而使子宮內(nèi)膜局部雌激素合成增加, 患雌激素依賴性疾病的風(fēng)險(xiǎn)也更大。在3-10組中, 二惡英暴露次數(shù)和3-3組相同, 但劑量加大, 使子宮內(nèi)膜中細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá)量也更大, 說明細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá)量隨二惡英劑量增加而增加, 使雌激素分泌進(jìn)一步增加, 患病風(fēng)險(xiǎn)也更大。Boverhof等的研究也表明二惡英可產(chǎn)生一種類似雌激素的作用。

二惡英是目前國際上公認(rèn)的最嚴(yán)重的生殖危險(xiǎn)環(huán)境污染物之一, 流行病學(xué)調(diào)查顯示, 長時間暴露在二惡英中不僅患生殖系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加, 還能夠增加人體其他疾病的患病率, 如惡性腫瘤等。醫(yī)務(wù)人員應(yīng)積極采取相應(yīng)措施來防范其對人體的危害, 如提倡垃圾及時分類處理, 控制焚燒, 從而降低二惡英類化合物的排放量, 減少二惡英所引起的相關(guān)疾病的發(fā)生［2］。

［1］ 張麗君, 黃向華.四氯二苯并二惡英與婦科疾病.國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志, 2011, 30(2):134-137.

［2］ 郭玉梅,王沭沂,王心如.二惡英對獼猴妊娠期及其妊娠結(jié)局的毒性影響.中國公共衛(wèi)生, 2000, 16(11):1001-1002.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.02.183

2014-09-04］

473000 南陽醫(yī)專一附院婦科