王華先

熒光原位雜交技術(shù)及染色體核型分析在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值

王華先

目的探討熒光原位雜交技術(shù)(FISH)及染色體核型分析在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用價值。方法 抽取90例婦產(chǎn)科就診孕婦的羊水進(jìn)行體外培養(yǎng)并進(jìn)行染色體核型分析, 其中對45例羊水樣本應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù), 直接對間期核細(xì)胞進(jìn)行13、18、X、Y等染色體數(shù)目進(jìn)行檢測。結(jié)果 90例羊水樣本有88例樣本完成染色體核型分析, 診斷成功的幾率為97.78%, 其中2例患者出現(xiàn)異常染色體核型的情況, 占2.22%, 報告的時間平均為(23.49±5.11)d。在應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)的45例樣本中, 診斷成功的幾率為100.00%, 其中有8例患者出現(xiàn)異常染色體核型的情況, 占8.89%, 其中, 結(jié)構(gòu)異常5例,數(shù)目異常3例。另外, 在染色體數(shù)目的診斷上, 熒光原位雜交技術(shù)與染色體核型分析的診斷結(jié)果一致,平均報告的時間為(2.78±4.13)d。結(jié)論 熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷中具有成功率、準(zhǔn)確性高的特點, 能夠有效縮短報告的時間, 但是對于某些情況特殊的患者來說, 單純地使用熒光原位雜交技術(shù)則有可能造成漏診的現(xiàn)象發(fā)生, 因此熒光原位雜交技術(shù)并不能完全取代染色體核型分析技術(shù), 在必要時需要同時使用兩種技術(shù)。

熒光原位雜交技術(shù)；染色體核型分析；產(chǎn)前診斷；臨床應(yīng)用價值

為了探討光原位雜交技術(shù)及染色體核型分析在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用價值, 本院特進(jìn)行了一次研究, 取得了較為良好的效果, 現(xiàn)將具體情況報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取梅州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的孕婦90例作為研究的主要對象, 年齡最小19歲, 最大47歲, 平均年齡(32.74±5.87)歲, 高齡孕婦(年齡≥52歲)18例、血清學(xué)篩查異常20例、Down’s高風(fēng)險16例、胎兒畸形17例、不良孕產(chǎn)史19例。

1.2 診斷方法 本次研究中所需要用到的儀器有：染色體核型分析系統(tǒng)、熒光原位雜交(FISH)分析系統(tǒng)、熒光顯微鏡、雜交儀、電熱恒溫水浴箱、普通低速離心機、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、微量加樣器等。

抽取所有孕婦的羊水進(jìn)行體外培養(yǎng)并進(jìn)行染色體核型分析, 其中對45例羊水樣本應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)。在B超定位的引導(dǎo)下, 經(jīng)腹部性羊膜腔刺穿術(shù), 抽取羊水35 ml, 其中30 ml羊水用于細(xì)胞培養(yǎng), 5 ml羊水準(zhǔn)備FISH實驗, 羊水細(xì)胞離心后放置在無菌玻璃試管內(nèi)備用。以下是熒光原位雜交技術(shù)的相關(guān)步驟。

1.2.1 制備樣本玻片 取2～5 ml羊水, 2000 r/min , 離心10 min,去上清制成細(xì)胞懸液, 留沉淀0.2 ml。在離心管中加入5 ml預(yù)溫的0.075 mol/L KCl, 并且在37℃水浴中低滲30 min。離心10 min后去上清, 加入用甲醇和冰醋酸新配制的固定液兩者的比例為3∶1, 進(jìn)行10 min的預(yù)固定, 重復(fù)上述離心步驟,重復(fù)固定2次, 10 min/次。讓滴片自然干燥后放置在-20℃冰箱進(jìn)行保存。

1.2.2 進(jìn)行變性雜交 主要的過程為：選擇13號、18號、21號、X、Y染色體特異性探針。將按照上述步驟制備好的羊水、絨毛玻片自冰柜中取出, 依次放入70%、85%、100%乙醇中進(jìn)行脫水處理。用10 μl橘紅色的探針在玻片的雜交區(qū)域滴加混合物, 并且在靶區(qū)域蓋上蓋玻片, 避免產(chǎn)生氣泡。值得注意的是, 這一系列的過程需要在暗室中操作。最后用橡膠泥將蓋玻片封好, 放置在37℃的暗濕盒中雜交16 h［1］。

1.2.3 進(jìn)行玻片的洗滌工作 去掉蓋玻片, 用SSC溶液進(jìn)行漂洗、乙醇漂洗。另外需要在暗室中將其進(jìn)行自然風(fēng)干,并且加6 μl DAPⅡ復(fù)染。在靶區(qū)域加蓋玻片。

1.2.4 對結(jié)果進(jìn)行觀察 應(yīng)用熒光顯微鏡, 激發(fā)光濾片、圖像分析系統(tǒng)在鏡下觀察雜交效果。細(xì)胞雜交率在80%以上為有效標(biāo)本。另外, 在判定的過程中需要注意細(xì)胞核膜是否完整。在細(xì)胞核內(nèi)可見清晰明亮的桔紅色熒光信號, 需要根據(jù)熒光點直接的大小來記錄數(shù)量。例如, 出現(xiàn)2個或3個熒光點, 并且2個位點之間距離＞單個信號的直徑以上, 熒光強度相近, 計為含有2 條或3 條染色體。兩個信號之間的距離＜1個信號的直徑則計數(shù)為1 條染色體。記錄雜交信號數(shù)目并錄入圖像分析儀。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察13、18、X、Y等染色體數(shù)目、報告平均時間和診斷的成功幾率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 診斷的成功幾率 90例羊水樣本有88例樣本完成染色體核型分析, 診斷成功的幾率為97.78%。應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)的45例樣本中, 診斷成功的幾率為100.00%。

2.2 異常核型出現(xiàn)情況 染色體核型分析中2例患者出現(xiàn)異常染色體核型的情況, 所占的比例為2.22%, 熒光原位雜交技術(shù)中8例患者出現(xiàn)異常染色體核型的情況, 所占的比例為8.89%, 結(jié)構(gòu)異常的有5例, 數(shù)目異常的有3例。

2.3 報告的時間比較 染色體核型分析報告的時間平均為(23.49±5.11)d, 熒光原位雜交技術(shù)平均報告的時間為(2.78± 4.13)d。

3 討論

熒光原位雜交技術(shù)簡稱為FISH, 是近幾年根據(jù)發(fā)展的需要而出現(xiàn)的一種診斷新方式, 主要的原理是利用其特殊的探針進(jìn)行DNA雜交, 經(jīng)免疫熒光顯色后檢測細(xì)胞內(nèi)特異DNA是否存在［2］, 適用的范圍較為廣泛, 但主要應(yīng)用于檢測染色體中期分裂相和未培養(yǎng)細(xì)胞間期核是否異常。這一方式能夠在產(chǎn)前對孕婦進(jìn)行快速診斷, 能在孕早期識別胎兒的嚴(yán)重先天缺陷, 診斷的情況主要為高齡孕婦、血清學(xué)篩查異常、Down’s高風(fēng)險、胎兒畸形、不良孕產(chǎn)史等［3］。

染色體核型分析是傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方式, 也是臨床中應(yīng)用最多、效果最為穩(wěn)定、準(zhǔn)確率較高的方式之一, 既能夠檢測染色體是否出現(xiàn)數(shù)目異常的現(xiàn)象, 又能夠達(dá)到檢測染色體結(jié)構(gòu)異常的目標(biāo), 被醫(yī)學(xué)界稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”［4］。但是由于染色體核型分析是建立在羊水細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上, 體外培養(yǎng)耗時較多, 成為了主要弊端［5］。而熒光原位雜交技術(shù)這種新方式的出現(xiàn)有效地避免了這一弊端, 真正實現(xiàn)了對DNA片段的定量和定位分析。本次研究中, 本院采用了熒光標(biāo)記探針對13、18、X、Y等染色體的數(shù)目進(jìn)行了檢測, 平均報告所需要的時間明顯短于染色體核型分析。但是在本次研究中也發(fā)現(xiàn)了此種技術(shù)的缺陷, 即高齡產(chǎn)婦在應(yīng)用FISH技術(shù)時具有較大的風(fēng)險, 漏診的幾率將會達(dá)到0.5%。

綜上所述, 熒光原位雜交技術(shù)及染色體核型分析在產(chǎn)前診斷中具有極強的臨床應(yīng)用價值, 這一方式值得在臨床中大力推廣應(yīng)用。

［1］ 趙煒, 俞冬熠, 張凱.羊水細(xì)胞培養(yǎng)及熒光原位雜交技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用.中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2013, 21(4):57-59.

［2］ 柳宛璐, 喬福元, 唐紅菊, 等.熒光原位雜交技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志, 2013, 29(3):197-199.

［3］ 姜淑芳, 盧彥平, 付玉榮, 等.染色體熒光原位雜交快速產(chǎn)前診斷染色體數(shù)目異常.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2013, 34(8):808-810, 813.

［4］ 黎青.DMD基因診斷體系建立、應(yīng)用和羊水iPSCs構(gòu)建.南方醫(yī)科大學(xué), 2013.

［5］ 朱義保, 劉艷秋, 李宇中, 等.熒光原位雜交技術(shù)在未培養(yǎng)羊水細(xì)胞產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究.實用婦產(chǎn)科雜志, 2011, 27(1): 46-48.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.12.057

2014-12-22］

514089 廣東梅州市人民醫(yī)院檢驗科