劉相波

禽流感病毒屬于甲型流感病毒[1]。人感染禽流感是由禽流感病毒引起的人類疾病，根據(jù)禽流感病毒對雞和火雞的致病性不同，可將其分為低/非致病性、中、高三級[2]。由于禽流感病毒的血凝素結(jié)構(gòu)等特點，一般感染禽類，在病毒復(fù)制過程中，出現(xiàn)基因重配，導(dǎo)致病毒結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，獲得感染人的能力，最終導(dǎo)致人感染禽流感疾病的發(fā)生[3]。近年來，禽流感不僅造成了人類的傷亡，同時還對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了重創(chuàng)[4]。近年來先后在朝鮮、越南、泰國、韓國、日本、中國等10多個亞洲國家爆發(fā)H5N1高致病性禽流感病毒，引起全球的高度關(guān)注[5]。此次研究對在2008年1月-2014年1月中國內(nèi)地人禽流感患者25例進(jìn)行研究，對其病理組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及病因?qū)W特點進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月-2014年1月中國內(nèi)地人禽流感患者25例作為研究對象，其中男16例，女9例，年齡22~86歲，25例患者均符合《人感染禽流感診斷方案》中的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者流行病學(xué)接觸史、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結(jié)果，可作出人感染H5N1禽流感診斷。流行病學(xué)史不詳?shù)幕颊?，根?jù)臨床表現(xiàn)、輔助檢查和實驗室檢測結(jié)果，從患者呼吸道分泌物標(biāo)本中分離出禽流感病毒，或禽流感病毒核酸檢測為陽性，或動態(tài)檢測雙份血清禽流感病毒特異性抗體陽轉(zhuǎn)或呈4倍或以上升高[6]。

1.2 方法

1.2.1 胸腔局部解剖 對已死亡的1例患者進(jìn)行胸腔局部解剖，摘除患者氣管、雙肺及心臟。

1.2.2 病理組織學(xué)制片與觀察 使用4%甲醛對標(biāo)本進(jìn)行固定，使用石蠟包埋，然后連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，然后在光學(xué)顯微鏡下對病理學(xué)組織進(jìn)行觀察。

1.2.3 組織化學(xué)染色 Macchiavello病毒包含體染色和網(wǎng)織纖維染色。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 采用單克隆抗體CK、CD68、CD20、CD8、CD4、CD3、S-100，EnVisionTM二步法染色，然后在光學(xué)顯微鏡下對其進(jìn)行觀察。

1.2.5 電鏡制片與觀察 使用2.5%預(yù)冷戊二醛對組織標(biāo)本進(jìn)行固定，1%鋨酸后固定，使用樹脂包埋，然后將其超薄切片，使用乙酸鈾-檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，然后使用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.2.6 病原體分離培養(yǎng)鑒定、全基因組序列測定及動物致病性觀察 細(xì)胞培養(yǎng)特性和培養(yǎng)細(xì)胞電鏡觀察；RT-PCR測定與部分基因序列分析；血清學(xué)試驗；全基因組序列測定和分析比較；新分離禽流感病毒動物致病性觀察。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 對行胸部局部解剖的患者觀察發(fā)現(xiàn)，該名患者左側(cè)胸腔內(nèi)有黃色渾濁液體約400 mL，其左側(cè)胸腔內(nèi)有少量淡黃色液體，該名患者壁胸膜外觀呈現(xiàn)淡紅色。氣管黏膜充血，并且氣管腔內(nèi)有少量淡紅色分泌物?；颊咦蠓紊舷氯~外觀呈現(xiàn)出廣泛性實變狀，呈暗紅色，其切面有粉紅色泡沫狀液體流出；左肺呈現(xiàn)出淡粉紅色，散在斑片狀暗紅色區(qū)。心包內(nèi)存在少量的淡黃色液體?；颊咝呐K外觀正常。

2.2 光鏡檢查

2.2.1 肺臟 左肺臟主要表現(xiàn)為廣泛性肺實變，顯著的肺水腫和肺出血及壞死。急性彌漫性肺泡損傷表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞增生，核增大，染色質(zhì)濃聚，部分肺泡上皮細(xì)胞可以看見核異型性及核分裂象。患者肺泡腔內(nèi)有大量的蛋白性滲出液，大量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞，少量的中性粒細(xì)胞及變性壞死脫落的肺泡上皮細(xì)胞以及多核或合體樣肺泡細(xì)胞，并且伴有明顯的透明膜形成；肺泡隔沒有明顯的增寬，有部分的小血管壁亦呈現(xiàn)纖維素性壞死，并且有少量的血栓形成。有部分區(qū)域的肺泡隔已經(jīng)出現(xiàn)較為嚴(yán)重的損毀及壞死，融合成片，并且伴有大量的中性粒細(xì)胞浸潤。左肺病變較重，又肺病變較輕，肺組織內(nèi)出血、充血呈灶狀或片狀分部。肺泡腔內(nèi)有大量的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞及少量的水腫液、中性粒細(xì)胞等改變，有透明膜形成。支氣管：黏膜中可以看見有淋巴細(xì)胞核巨噬細(xì)胞浸潤；部分小支氣管出現(xiàn)壞死，并且充滿了炎性滲出物。

2.2.2 心臟 心包小血管充血。心肌間質(zhì)水腫，少量淋巴細(xì)胞浸潤。

2.3 免疫組織化學(xué)

2.3.1 肺臟 增生和脫落的肺泡上皮細(xì)胞及肺泡腔內(nèi)的合體和多核細(xì)胞均呈現(xiàn)CK陽性反應(yīng)。巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)CD68陽性染色；只有少量的淋巴細(xì)胞CD3為陽性，標(biāo)記B細(xì)胞的抗體CD79a及CD20均呈現(xiàn)陰性。SARS冠狀病毒S蛋白單克隆抗體染色呈陰性。

2.3.2 心臟 心肌間質(zhì)可以看見CD68陽性細(xì)胞浸潤，并且可看見有少量的CD3陽性淋巴細(xì)胞浸潤。

2.4 組織化學(xué)染色 （1）病毒包涵體染色：少量肺泡上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在嗜酸性染色球形顆粒。（2）網(wǎng)織纖維染色：患者肺部壞死區(qū)域內(nèi)肺泡壁網(wǎng)織纖維出現(xiàn)斷裂，崩解消失。

2.5 電鏡檢查 Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮存在明顯的細(xì)胞腫脹，并且細(xì)胞表面微絨毛減少，肺泡表面活性物質(zhì)膜消失，并且能夠觀察到細(xì)胞凋亡和壞死。Ⅱ型肺泡細(xì)胞核體積增大，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，能夠看見線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴(kuò)張。胞質(zhì)內(nèi)板層小體及早期病例相比數(shù)量增加。肺泡間隔內(nèi)血管內(nèi)皮紅細(xì)胞出現(xiàn)腫脹及空泡變性，肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)可看見巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和脫落的上皮細(xì)胞。在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞可以看到A型流行性感冒病毒樣顆粒，多數(shù)呈現(xiàn)出球形，有囊膜，大小約為80~120 nm，高電子密度核心居中的C型病毒顆粒數(shù)量較多，低電子密度核心的A型病毒顆粒數(shù)量較少。

2.6 病原體分離培養(yǎng)鑒定

2.6.1 病原體的分離培養(yǎng) 將血漿標(biāo)本接種Vero細(xì)胞16 h，觀察到細(xì)胞出現(xiàn)病變，24 h后，CPE達(dá)到4+。經(jīng)0.2 μm孔徑的濾膜過濾后分別接種Vero細(xì)胞，出現(xiàn)CPE，與未經(jīng)過過濾的樣品無差別。除Vero細(xì)胞外，接種MDCK細(xì)胞，在MDCK細(xì)胞進(jìn)行試驗時出現(xiàn)病變時間相對于Vero細(xì)胞較早。2.6.2 培養(yǎng)細(xì)胞電鏡形態(tài)學(xué)觀察 在細(xì)胞外能夠看到大量的病毒顆粒，并且有明顯的突起，細(xì)胞內(nèi)可見少量的病毒。

2.6.3 RT-PCR測定 RT-PCR測定與部分基因序列分析均擴(kuò)增出A型流感病毒的部分M和HA基因片段。擴(kuò)增測序的M基因片段核苷酸序列與禽流感病毒的同源性為96%。HA基因片段核苷酸序列與禽流感病毒的同源性為97%。

2.6.4 血清學(xué)試驗 抗禽流感病毒特異血清H5N1、H9N1、N7N7特異血清。采用酶標(biāo)抗體染色法、間接免疫熒光染色、血凝抑制試驗。使用雞抗禽流感病毒H5、H7、H9特異抗體進(jìn)行酶標(biāo)染色，然后分離病毒與雞抗禽流感病毒H5N1亞型特異抗體均呈現(xiàn)出陽性反應(yīng)。免疫酶標(biāo)染色、血凝抑制試驗均與H5N1亞型特異抗體呈現(xiàn)出強(qiáng)陽性反應(yīng)。與SARS的特異抗體的反應(yīng)均呈現(xiàn)出陰性。

3 討論

人禽流行性感冒是由A型禽流感病毒的某些亞型毒株所造成的患者出現(xiàn)急性呼吸道傳染病，患者病死率較高，并且尚無有效的治療[7-8]。目前對有關(guān)人禽流感病原學(xué)、流行病學(xué)及其檢測的研究已經(jīng)有了進(jìn)展，但關(guān)于人禽流感的發(fā)生及發(fā)展的病理過程及臨床特點還沒有定論，需要進(jìn)一步的探索[9-10]。

此次研究使用電鏡、光鏡、免疫組織化學(xué)、組織化學(xué)方法對25例患者臨床表現(xiàn)為多器官衰竭和急性呼吸窘迫的高致病性禽流感病毒H5N1亞型感染病例進(jìn)行觀察和研究，從而研究人感染高致病性禽流感病毒H5N1的病理學(xué)和病原學(xué)特點。

人感染禽流感病毒后，病毒在體內(nèi)的潛伏期約為1周，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱>39 ℃、氣促、呼吸困難、呼吸窘迫等；部分患者會出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、惡心等表現(xiàn)；癥狀較為嚴(yán)重的患者肺部病變發(fā)展較為快速，出現(xiàn)大片實變陰影，呈重癥急性肺炎改變，可能會出現(xiàn)急性呼吸窘迫、胸腔積液、多器官功能衰竭、肺出血等癥狀，患者病死率較高[11-12]。

綜上所述，高致病性A型禽流感病毒會導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重急性病毒性肺炎，肺水腫、肺實變、明顯的出血性壞死性炎癥等病理改變?yōu)槠渲饕卣?。電鏡檢查可見A型禽流感病毒樣顆粒。研究人禽流行性感冒的病原學(xué)和病理學(xué)特點，為將來的人禽流感臨床診斷和治療方案提供了理論基礎(chǔ)和病理學(xué)基礎(chǔ)。

[1]蔡孟華，李錚，董鵬，等.高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白中和抗體及表位的鑒定[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，34（5）：633-637.

[2]彭海燕，遲瑩，李燕，等.高致病性禽流感病毒H5N1亞型核蛋白NP真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，25（5）：6-9.

[3]楊敏，成凌志，王偉.湘潭市高危場所環(huán)境中高致病性禽流感病毒（H5N1）的監(jiān)測結(jié)果分析[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，21（3）：366-368.

[4]曹志亮.高致病性禽流感病毒H5N1中和抗體表位及機(jī)制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2012.

[5]吳瑞平.高致病禽流感病毒H5N1中和抗體表位的研究[D].溫州：溫州醫(yī)學(xué)院，2013.

[6]莊麗，蒙黎明，趙文榮，等.貴州省2012年度禽流感病毒H5N1亞型HA-1基因分析[J].貴州醫(yī)藥，2013，37（6）：492-494.

[7]單云峰，李燕，遲瑩，等.H5N1亞型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，25（3）：1-3.

[8]冼盈，朱翔，張永標(biāo)，等.不同H5N1亞型高致病性禽流感病毒誘導(dǎo)IFN-α/β和MxA mRNA表達(dá)[J].中國病理生理雜志，2012，28（4）：708-713.

[9]呂星，王曉輝，吳春利，等.H5N1亞型禽流感病毒誘導(dǎo)的機(jī)體免疫損傷分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2013，29（7）：697-699.

[10]張立霞，于在江，周劍芳，等.H5N1禽流感病毒headless HA基因在桿狀病毒中的表達(dá)[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2012，26（3）：179-181.

[11]劉麗琦，余慧燕，于在江，等.H5N1禽流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因在桿狀病毒中的共表達(dá)[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，21（5）：543-546.

[12]孫麗娟，張雪梅，夏咸柱，等.H5N1禽流感病毒感染豚鼠體內(nèi)MAVS基因表達(dá)情況研究[A].2013中國生物制品年會暨第十三次全國生物制品學(xué)術(shù)研討會論文集[C]，上海，2013.