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        PSD-95抑制劑在缺血性腦損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用

        2015-02-01 09:20:30歐陽(yáng)馥冰陳藝聰曾進(jìn)勝
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)模型研究

        歐陽(yáng)馥冰陳藝聰曾進(jìn)勝

        ·綜 述·

        PSD-95抑制劑在缺血性腦損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用

        歐陽(yáng)馥冰*陳藝聰*曾進(jìn)勝*

        腦缺血 神經(jīng)保護(hù)藥 PDZ結(jié)構(gòu)域

        迄今絕大多數(shù)在腦缺血?jiǎng)游锬P椭凶C實(shí)有效的神經(jīng)保護(hù)藥物,進(jìn)入臨床試驗(yàn)后都被證實(shí)無(wú)效甚至有害[1]。近年來(lái),突觸后致密物-95(postsynaptic density-95,PSD-95)抑制劑成為神經(jīng)保護(hù)治療研究的新熱點(diǎn)。本文對(duì)PSD-95抑制劑Tat-NR2B9c(NA-1)從離體細(xì)胞、嚙齒類動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物到人體試驗(yàn)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

        1 離體細(xì)胞中證實(shí)抑制PSD-95可減輕缺血性神經(jīng)元損傷

        PSD-95是一種細(xì)胞腳手架蛋白,通過其氨基端2個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域與N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-as?partate receptor,NMDAR)的NR2亞基羧基端結(jié)合,將NM?DAR錨定在突觸后膜活性區(qū),并募集細(xì)胞質(zhì)的神經(jīng)元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOs),使其移位到細(xì)胞膜上,形成NMDAR/PSD-95/nNOs蛋白三聚體[2]。急性腦缺血時(shí),NMDAR過度激活介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流可激活Ca2+依賴的nNOs,催化生成NO,最終產(chǎn)生大量自由基[3]。

        Michelle Aarts等[3]利用NR2B亞基羧基端的9個(gè)氨基酸與Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合產(chǎn)生一種PSD-95抑制劑Tat-NR2B9c(NA-1)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該多肽分子能穿透細(xì)胞膜,干擾PSD-95與NMDAR的結(jié)合,減少NO的生成(圖1)。NO和自由基生成的減少,有助于減輕線粒體損傷和ATP消耗,提高細(xì)胞存活率[4]。NA-1不影響NMDAR的表達(dá)、NMDAR介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)nNOs的正常功能,可避免直接阻斷NMDAR及抑制nNOs活性造成的不良反應(yīng)[2-3]。

        NA-1還可通過激活鈣調(diào)蛋白激酶IV(calmodulin ki?nase IV,CaM IV)依賴的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB),促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及神經(jīng)保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[5]。這提示PSD-95抑制劑可通過影響NMDAR下游的其他信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

        2 PSD-95抑制劑縮小大鼠腦梗死灶體積并改善神經(jīng)功能

        在嚙齒類動(dòng)物中,NA-1經(jīng)外周靜脈注射后能通過完整的血腦屏障[3]。Michelle Aarts等[3]在短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)大鼠模型中證實(shí),卒中前45 min、卒中后1 h單次靜脈注射NA-1(7.5 mg/kg),卒中后24 h腦梗死灶體積較對(duì)照組明顯減小(約54.6%、67.0%),伴隨神經(jīng)功能的改善。

        為進(jìn)一步探討不同梗死嚴(yán)重程度、性別及給藥時(shí)間窗對(duì)NA-1神經(jīng)保護(hù)作用的影響,Sun等[6]進(jìn)行了一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)1選用雌、雄大鼠,開顱電凝一側(cè)大腦中動(dòng)脈3支軟腦膜分支,此法梗死灶較小,程度輕,且不影響卒中后動(dòng)物的體溫。卒中后1 h單次給藥,24 h后雌、雄大鼠梗死灶體積均較對(duì)照組減少約60%,提示NA-1在不同性別的嚙齒類動(dòng)物中均有神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)2制備永久性大腦中動(dòng)脈阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO)模型,此法梗死灶大,神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重,死亡率較高,無(wú)法觀察長(zhǎng)期神經(jīng)功能變化,且術(shù)后大鼠核心溫度迅速升高,24 h內(nèi)維持在高于39℃的水平,這與臨床卒中后常見的高熱并發(fā)癥相似。卒中后1 h給藥使24 h梗死灶體積減少約40%,提示NA-1在梗死程度重、合并高熱的情況下仍起作用。實(shí)驗(yàn)3制備tMCAO模型,給藥時(shí)間窗延長(zhǎng)至卒中后3 h,觀察終點(diǎn)延長(zhǎng)至卒中后62 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)卒中后24 h及62 d梗死灶體積分別減小了50%及80%,伴隨神經(jīng)功能恢復(fù),提示NA-1給藥時(shí)間窗可延長(zhǎng)至卒中后3 h并改善近、遠(yuǎn)期神經(jīng)功能。

        圖1 Tat-NR2B9(NA-1)可與PSD-95的PDZ1或PDZ2結(jié)合,干擾蛋白三聚體NMDAR/PSD-95/nNOs的形成,阻斷興奮性毒性信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]

        除了證實(shí)NA-1的有效性,研究人員還利用嚙齒類動(dòng)物模型進(jìn)一步探討NA-1的作用機(jī)制。Bernt T.Br?tane等[4]在大鼠卒中后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行核磁共振灌注加權(quán)成像(perfusion weighted imaging,PWI)和彌散加權(quán)成像(diffu?sion weighted imaging,DWI),通過DWI與PWI的不匹配觀察缺血半暗帶的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NA-1在不增加局部腦血流量的情況下明顯延緩缺血半暗帶的進(jìn)展,提示NA-1有可能延長(zhǎng)溶栓治療時(shí)間窗。

        雖然NA-1在嚙齒類動(dòng)物中展現(xiàn)了良好的神經(jīng)保護(hù)作用,但嚙齒類與靈長(zhǎng)類動(dòng)物在神經(jīng)解剖、生理等方面的差異,可造成兩者對(duì)藥物反應(yīng)性不同[7-8]。根據(jù)2009年卒中治療學(xué)術(shù)行業(yè)圓桌會(huì)議(Stroke Therapy Academic Industry Roundtable,STAIR)的建議,除了嚙齒類動(dòng)物,神經(jīng)保護(hù)治療需要在與人類有更高相似程度的多腦回(gyrencephalic)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(nonhuman primates,NHPs)中得到研究[9]。

        3 非人靈長(zhǎng)類腦缺血?jiǎng)游锬P椭蠵SD-95抑制劑的神經(jīng)保護(hù)作用

        NHPs研究多以狒狒為模型,其腦血管側(cè)支循環(huán)豐富,為提高模型制備的成功率,需同時(shí)閉塞一側(cè)大腦中動(dòng)脈和雙側(cè)大腦前動(dòng)脈。此法梗死灶較大,急性期死亡率高,并影響狒狒的雙目視力,不利于行為學(xué)檢測(cè)[8]。狨猴也常用于復(fù)制腦梗死模型,但其屬于缺腦回(lissencephalic)動(dòng)物[8]。食蟹猴大腦無(wú)豐富的側(cè)支循環(huán),屬多腦回,其腦組織和血管解剖與人類較相似。因此,Douglas J.Cook等[10]選擇食蟹猴(cynomolgus macaque)進(jìn)行NA-1的相關(guān)研究,分別進(jìn)行以下4個(gè)實(shí)驗(yàn)。

        實(shí)驗(yàn)1夾閉發(fā)出眶額支近端,制備90 min tMCAO模型。卒中后1 h單次注射NA-1(2.6 mg/kg),卒中后4 h、24 h及30 d利用DWI、T2WI及組織學(xué)方法測(cè)量梗死灶大小,同時(shí)利用NHPSS(Nonhuman Primate Stroke Scale)評(píng)價(jià)神經(jīng)功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)卒中后24 h及30 d梗死灶體積較對(duì)照組減少55%和70%,伴隨神經(jīng)功能改善。實(shí)驗(yàn)2夾閉眶額支遠(yuǎn)端,制備pMCAO模型。卒中后1 h、6 h取缺血半暗帶組織活檢,提取其神經(jīng)元RNA行全基因組表達(dá)譜芯片雜交,證實(shí)NA-1有助于缺血神經(jīng)元保持內(nèi)源性保護(hù)性基因的轉(zhuǎn)錄功能。實(shí)驗(yàn)3與實(shí)驗(yàn)4通過動(dòng)脈瘤夾的關(guān)閉和開放復(fù)制4.5 h及3.5 h tMCAO模型,模擬臨床溶栓后再灌注。分別于卒中后1 h及3 h給藥,結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥組梗死灶體積較對(duì)照組明顯減小,伴隨神經(jīng)功能改善,提示NA-1有可能與rt-PA聯(lián)用并延長(zhǎng)其治療時(shí)間窗。

        該研究是目前開展的最大樣本(n=62)NHPs研究,首次應(yīng)用MRI技術(shù)評(píng)價(jià)NHPs的缺血半暗帶,并模擬臨床應(yīng)用的NIHSS(National Institute of Health Stroke Scale),采用NHPSS對(duì)NHPs卒中后近、遠(yuǎn)期神經(jīng)功能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。研究仍存在一些問題:①平均每組的樣本量仍較少(n= 6-7),存在一定的抽樣誤差;②研究選擇的是雄性、年輕、健康、無(wú)并發(fā)癥的動(dòng)物,與多有血管基礎(chǔ)病變的臨床實(shí)際不符,應(yīng)考慮選擇不同性別、年齡及健康狀態(tài)的動(dòng)物;③NHPSS評(píng)分的可靠性尚未得到充分肯定;④需要在血栓栓塞性腦卒中動(dòng)物模型中進(jìn)一步探討NA-1與rt-PA聯(lián)合治療的可能[11-12]。

        Douglas J.Cook等[13]還根據(jù)當(dāng)時(shí)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)ENACT(Evaluating Neuroprotection in Aneurysm Coiling Therapy),設(shè)計(jì)了另一項(xiàng)NHPs研究。實(shí)驗(yàn)人員從食蟹猴頸內(nèi)動(dòng)脈注射多聚乙烯微球制備多發(fā)性腦栓塞模型,模擬人顱內(nèi)動(dòng)脈瘤介入術(shù)后繼發(fā)的醫(yī)源性栓塞,1 h后單次給藥,24 h及30 d后利用MRI和組織學(xué)檢查,發(fā)現(xiàn)NA-1可明顯減少卒中病灶數(shù)目和大小(約64%、64%)。此結(jié)果與ENACT基本一致,提示該靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)是有效的,該模型可能也適用于其他神經(jīng)保護(hù)藥的研究。

        4 臨床研究初步證實(shí)PSD-95抑制劑的有效性和安全性

        與Douglas J.Cook模擬顱內(nèi)動(dòng)脈瘤介入術(shù)后繼發(fā)腦栓塞的NHPs研究相對(duì)應(yīng),自2008年到2011年開展了一項(xiàng)II期、多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)ENACT(ClinicalTrials.gov.Indentifier:NCT00728182),初步證實(shí)NA-1在防治顱內(nèi)動(dòng)脈瘤介入術(shù)后繼發(fā)腦栓塞的有效性和安全性。此項(xiàng)研究共入組185例患者,包括顱內(nèi)動(dòng)脈瘤未破裂或已破裂繼發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血,在行血管介入術(shù)后馬上靜脈給予NA-1(2.6mg/kg),12~96 h內(nèi)進(jìn)行MRI檢查,發(fā)現(xiàn)NA-1可減少繼發(fā)卒中的病灶數(shù)量,但對(duì)病灶大小沒有影響。而亞組分析顯示,NA-1不僅能減少動(dòng)脈瘤破裂組卒中病灶數(shù)量,還能減小病灶體積。但該亞組樣本量不足(n=37)。研究過程中,NA-1給藥組未出現(xiàn)明顯的毒副反應(yīng),部分患者在給藥后24 h出現(xiàn)短暫的低血壓(舒張壓下降約9 mmHg),但數(shù)分鐘內(nèi)自行恢復(fù)[14]。

        臨床上,除了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤介入術(shù),頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)、頸內(nèi)動(dòng)脈支架植入術(shù)、房顫射頻消融術(shù)等都有出現(xiàn)繼發(fā)醫(yī)源性栓塞的風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。這種類型的卒中一般累及終末小動(dòng)脈,無(wú)明顯的感覺運(yùn)動(dòng)功能缺失,因此未引起足夠重視。但嚴(yán)重的多發(fā)小梗死灶可損害認(rèn)知功能,造成血管性癡呆[17]。在這些患者中,NA-1能做到術(shù)后早期給藥以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,具有良好的發(fā)展前景。

        5 問題與展望

        PSD-95為卒中后神經(jīng)保護(hù)治療提供了一個(gè)新靶點(diǎn)。PSD-95抑制劑通過特異性地干擾PSD-95與NMDAR及其下游信號(hào)分子的結(jié)合,阻斷興奮性毒性信號(hào)的傳導(dǎo),從離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到小樣本人體試驗(yàn)均顯示出良好的神經(jīng)保護(hù)作用,其研究成果對(duì)指導(dǎo)未來(lái)其他神經(jīng)保護(hù)藥的研究有重要的借鑒意義。

        目前一項(xiàng)II期臨床試驗(yàn)ENACT-2(ClinicalTrials.gov. Indentifier:NCT02056574)將于2015年~2019年開展,計(jì)劃入組300例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂繼發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血的患者,以驗(yàn)證NA-1在防治此類病人血管介入治療后繼發(fā)腦栓塞的有效性和安全性[18]。另一項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)Field Ran?domization of NA-1 Therapy in Early Responders(FRON?TIER)也將于2015年~2017年開展,計(jì)劃入組558名急性腦缺血患者,在入院前卒中起病3 h內(nèi)為患者注射NA-1,進(jìn)一步評(píng)估NA-1的有效性和安全性[18]。這些臨床試驗(yàn)結(jié)果值得期待。

        NA-1臨床研究的初步成功使PSD-95抑制劑受到廣泛的關(guān)注,許多研究團(tuán)隊(duì)致力于開發(fā)新藥物,提高其生物學(xué)效應(yīng)。Tat-N-dimer是一種二聚體配體,將作用于PSD-95氨基端2個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的兩種多肽連接,在體外細(xì)胞及小鼠中初步證實(shí)比單體NA-1有更強(qiáng)的親和力和更長(zhǎng)的半衰期[19]。由于肽類藥物存在易被蛋白水解酶降解、給藥途徑受限、生產(chǎn)費(fèi)用較高、可能存在免疫排斥等缺點(diǎn),Zhou等[21]設(shè)計(jì)并合成出一種非肽類小分子藥物ZL006,可破壞nNOs β-finger結(jié)構(gòu),干擾PSD-95與nNOs的結(jié)合,在離體細(xì)胞及小鼠中初步證實(shí)其具有神經(jīng)保護(hù)作用。上述PSD-95新型抑制劑的有效性和安全性仍需更多臨床前及臨床研究結(jié)果的支持。

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        R743(

        2014-11-14)

        A(責(zé)任編輯:李立)

        10.3936/j.issn.1002-0152.2015.06.014

        * 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(廣州 510080)

        (E-mail:zengjs@pub.guangzhou.gd.cn)

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