王 征，張 寧，王翠玲，劉竹蘭，劉建利*

(1.西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710069;2.陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712083)

寒熱溫涼是中藥的基本屬性，寒涼和溫?zé)嶂皇浅潭炔煌酝ǔ：?jiǎn)稱為寒熱。寒熱證本質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)以熱藥造動(dòng)物熱證模型，可以用寒藥治療(逆轉(zhuǎn))，反之以寒藥造寒證模型可以用熱藥治療［1-2］。這是用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證中藥熱者寒之，寒者熱之的治療大法。通過觀察中藥對(duì)正常動(dòng)物多項(xiàng)生理生化指標(biāo)的影響，經(jīng)數(shù)據(jù)對(duì)比分析，得到中藥寒熱藥性與生理生化指標(biāo)間的關(guān)系，建立中藥寒熱藥性的評(píng)價(jià)模型［3-5］。以往的研究顯示熱藥能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而寒藥抑制生長(zhǎng)［6-12］，這些結(jié)果構(gòu)成了細(xì)胞中藥學(xué)的首次探索。如果以熱藥造熱證細(xì)胞模型(其主要表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng))，然后用寒藥逆轉(zhuǎn)。這樣就可以認(rèn)為在細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)熱者寒之，將豐富細(xì)胞中藥學(xué)的內(nèi)容。相對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要觀察眾多指標(biāo)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)只觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)及形態(tài)，相對(duì)簡(jiǎn)單了很多。

本研究分別以白胡椒、蓽菝、高良姜、吳茱萸、肉桂造熱證模型，然后用黃連、虎杖、白薇分別以5－800 μg/mL的濃度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。通過這樣的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證“熱者寒之”的基本治則對(duì)于細(xì)胞來說是否同樣適用。所選中藥造模濃度分別是白胡椒50 μg/mL、蓽菝 50 μg/mL、高良姜 100 μg/mL、吳茱萸 10 μg/mL、肉桂 20 μg/mL。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，由第四軍醫(yī)大學(xué)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 μQuant酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)、CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司)、細(xì)胞96孔培養(yǎng)板、普通倒置光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3 藥品與試劑 黃連、虎杖、白薇、白胡椒、蓽菝、高良姜、吳茱萸、肉桂(以上藥物均購(gòu)自西安藻露堂醫(yī)藥超市，經(jīng)西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院房敏峰高級(jí)工程師鑒定為正品藥材)、HyClone改良型RPMI-1640培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)、四季青無支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、MTT、磷酸緩沖液、0.25%胰蛋白酶(西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)、無菌水、去離子水、DMSO。

2 方法

2.1 受試藥品溶液的制備 稱取黃連20 g，虎杖20 g，白薇 20 g，白胡椒 20 g，蓽菝 20 g，高良姜 20 g，吳茱萸20 g，肉桂20 g，分別煎煮3次，每次30 min，合并水煎液，濃縮至20 mL，使各藥質(zhì)量濃度均為1 g/mL。藥液10 000 r離心30 min，上清液用0.22 μm的微孔濾膜濾過，無菌水稀釋至10 μg/μL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SGC-7901細(xì)胞消化于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(pH7.0 ～7.4)中，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)［13］。

2.3 MTT試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，接種于96孔板上。每孔200 μLRPMI-1640培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2及90%濕度條件下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)液(200 μL/孔)，造模各組分別加入不同體積的熱藥，造模濃度如上所述。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和調(diào)零孔，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄含造模藥物的培養(yǎng)基，用PBS洗清殘留藥物并加入新鮮培養(yǎng)基。再以相應(yīng)的寒藥進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。逆轉(zhuǎn)藥物濃度梯度為5 ～800 μg/mL。加藥完畢后96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換新鮮培養(yǎng)液(180 μL/孔)。每孔加入新鮮配制的0.5%MTT溶液20 μL，繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，每孔加入 150 μLDMSO，震蕩10 min(60次/min)后，用酶聯(lián)免疫標(biāo)定儀測(cè)定490 nm處吸光度(A)值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率為正值表示對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有抑制作用，負(fù)值表示對(duì)細(xì)胞有促增殖作用［14-15］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，組間比較采用方差分析。

3 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別用白胡椒 50 μg/mL、蓽菝 50 μg/mL、高良姜 100 μg/mL、吳茱萸 10 μg/mL、肉桂 20 μg/mL 進(jìn)行造模，再以黃連、虎杖、白薇 3味寒藥分 5～800 μg/mL8個(gè)濃度梯度分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。所得結(jié)果分述如下:白胡椒組造模濃度為50 μg/mL，抑制率為－191.91%。即白胡椒在50 μg/mL時(shí)對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用極強(qiáng)。分別用黃連、虎杖、白薇對(duì)白胡 椒的促進(jìn)作用進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表1。

表1 白胡椒造模數(shù)據(jù)表(白胡椒50 μg/mL、抑制率－191.91%)

由表1可以看出，黃連、虎杖、白薇3寒藥的抑制率都為正值，即對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)都表現(xiàn)為抑制。這說明3寒藥完全逆轉(zhuǎn)了白胡椒的促進(jìn)作用。達(dá)到了完全治療的效果。3寒藥的最佳逆轉(zhuǎn)濃度分別是:黃連800 μg/mL、虎杖 800 μg/mL、白薇800 μg/mL。為了更加直觀的看出3味寒藥的逆轉(zhuǎn)作用，以抑制率對(duì)濃度作圖，得到下圖1。

以同樣的方法用蓽菝 50 μg/mL、抑制率－29.82%，高良姜100 μg/mL、抑制率 －21.26%，肉桂20 μg/mL、抑制率 － 66.48%，吳茱萸 10 μg/mL、抑制率－22.82%，進(jìn)行造模，用黃連、虎杖、白薇進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如下表2、表3、表4、表5所示，為了更加直觀的看出黃連、虎杖、白薇對(duì)這4熱藥的逆轉(zhuǎn)作用，以抑制率對(duì)濃度作圖，得到了圖2、圖3、圖4、圖 5。

圖1 白胡椒造模折線圖

表2 蓽菝造模數(shù)據(jù)表(蓽菝50 μg/mL、抑制率－29.82%)

表3 高良姜造模數(shù)據(jù)表(高良姜100 μg/mL、抑制率－21.26%)

表4 肉桂造模數(shù)據(jù)表(肉桂20 μg/mL、抑制率－66.48%)

表5 吳茱萸造模數(shù)據(jù)表(吳茱萸10 μg/mL、抑制率－22.82%)

圖2 白胡椒造模折線圖

圖4 白胡椒造模折線圖

從以上表中可發(fā)現(xiàn)，黃連、虎杖、白薇作用于細(xì)胞后所得抑制率都為正值，即對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，即3味寒藥對(duì)蓽菝、高良姜、肉桂、吳茱萸4熱藥所產(chǎn)生的促進(jìn)作用都達(dá)到了逆轉(zhuǎn)的效果。而且最大抑制濃度基本都是800 μg/mL。從圖中可以直觀的看到，抑制率隨濃度增大而增大，具有比較好的濃度依賴關(guān)系。

圖3 白胡椒造模折線圖

圖5 白胡椒造模折線圖

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，所選寒藥可以完全逆轉(zhuǎn)熱藥對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。即中醫(yī)治則中“熱者寒之”在細(xì)胞水平同樣適用。

4 討論

“寒者熱之、熱者寒之”是中醫(yī)的基本治則。從以上結(jié)果可以看出，以熱藥造模寒藥逆轉(zhuǎn)效果良好。所用三種寒藥對(duì)造模熱藥的促進(jìn)作用逆轉(zhuǎn)完全。以抑制率對(duì)濃度作圖所得曲線基本也都是隨著濃度的增加而上升，濃度依賴型效果良好。最佳治療濃度基本都是800 μg/mL。原因是因?yàn)楹帉?duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是隨濃度的增大而增大的。所以在最大濃度800 μg/mL理應(yīng)是逆轉(zhuǎn)效果最佳的濃度。這些結(jié)果表明，在細(xì)胞水平上中醫(yī)治則“熱者寒之”是適用的，并豐富了細(xì)胞中藥學(xué)的內(nèi)容。

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