高 穎，高曉晨，李晶峰，郭曉慶，張 輝，孫佳明

(長春中醫(yī)藥大學，長春130117)

蟒蛇，又名蟒，王蛇，蚺蛇，南蛇，埋頭蛇，王字蛇，琴蛇，梅花蛇［1］，是當今世界上最原始的優(yōu)質(zhì)蛇種之一。蟒蛇肉在《名醫(yī)別錄》就有記載，其味甘，性溫，有小毒。除手足風痛，殺三蟲，去死肌，皮膚風毒癘風，疥辟惡瘡。具有祛風活絡，殺蟲止癢的功效，可用于風痹，癱瘓，癘風，疥廨，惡瘡 。在我國，蟒蛇主產(chǎn)于福建、廣東、海南、廣西、貴州、云南。近年來，蟒蛇的生存環(huán)境遭到破壞以及蟒蛇皮的市場需求加大致使蟒蛇的數(shù)量急劇下降，同時也刺激了蟒蛇的人工養(yǎng)殖。

生物活性肽(bioactive peptides)具有特殊的生物活性和生理功能，它一般是由3～20個氨基酸構成的多肽類物質(zhì)，通常情況下，其分子量在1萬Da以下。它由氨基酸組成，但其具有氨基酸所不能比擬的功效，生物活性肽源于蛋白質(zhì)，但更易被人體吸收和利用，甚至會出現(xiàn)原蛋白質(zhì)所不具備的新功能［2-3］。本文運用現(xiàn)代電噴霧多級質(zhì)譜法對蟒蛇肉酶解肽進行了分析研究，解析其中酶解肽的氨基酸序列。

1 材料與儀器

1.1 材料 蟒蛇肉酶解肽由長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心自制。

1.2 儀器 Agilent 6350 ESI-MS(美國 Agilent公司);GL-20G-Ⅱ型低溫超速離心機;FD-1000真空冷凍干燥機;UV-Visible Spectrophotometer;BP211D型十萬分之一電子天平 (北京賽多利斯天平有限公司)。

1.3 試劑 所用試劑均為色譜純。

2 方法

2.1 樣品制備 稱取1g蟒蛇肉酶解肽凍干粉，用10%MeOH定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，濾過，即得。

2.2 質(zhì)譜條件［4］電離源:電噴霧離子源(ESI);檢測方式:正離子檢測;掃描范圍:m/z 50～500;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流量:10 mL/min;霧化氣壓強:0.24 MPa(35.0 psi);毛細管電壓:4 kV。

2.3 樣品分析 采用蠕動泵直接進樣到離子源，利用質(zhì)譜工作站所能提供的離子信息，對樣品主要成分進行序列解析。從一級質(zhì)譜圖中，主要對m/z303、374的［M+H］+準離子峰進行分析，解析其主要寡肽類成分的氨基酸序列。

3 結果

3.1 m/z303離子的序列解析 一級質(zhì)譜中m/z為303的［M+H］+離子峰，說明其分子量為302，氨基酸的平均分子量為128，根據(jù)氮律分子應含奇數(shù)個氮，推斷其可能為三肽化合物。在碰撞誘導解離過程中，m/z 303離子失去一分子水(18 Da)生成m/z 285離子;m/z 303離子失去一分子丙氨酸(89 Da)生成m/z 214離子;m/z 303離子失去一分子丙氨酸(89 Da)和一分子脫水纈氨酸(117 Da)生成m/z 115離子，m/z 115為天冬酰胺脫去氨基而生成的離子。結合肽類裂解規(guī)律的文獻報道［5-7］，推知m/z為303的離子是由丙氨酸、纈氨酸和天冬酰胺三個氨基酸依次脫水形成酰胺鍵后生成的三肽，其氨基酸序列為AVN，結構式如圖1。

圖1 m/z 303離子結構式

3.2 m/z374離子的序列解析 一級質(zhì)譜中m/z為374的［M+H］+離子峰，說明其分子量為373，氨基酸的平均分子量為128，根據(jù)氮律分子應含偶數(shù)個氮，推斷m/z 374離子可能為四肽化合物。在碰撞誘導解離過程中，m/z374離子失去一分子水(18 Da)生成m/z 356離子;m/z 374離子失去一分子丙氨酸(89 Da)生成m/z 285離子;m/z 374離子失去一分子丙氨酸(89 Da)和一分子脫水丙氨酸(89 Da)生成m/z 214離子;m/z 374離子失去一分子丙氨酸(89 Da)、一分子脫水丙氨酸(89 Da)和一分子脫水纈氨酸(117 Da)生成m/z 115離子;m/z 115為天冬酰胺脫去氨基而生成的離子。結合肽類裂解規(guī)律，推斷m/z 374離子是由兩個丙氨酸、一個纈氨酸和一個天冬酰胺4個氨基酸依次脫水形成酰胺鍵后生成的四肽，故m/z374離子的氨基酸序列為AAVN，結構式如圖2。

圖2 m/z 374離子結構式

4 討論

生物活性肽具有多種生物學效應，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、抗血栓、降低膽固醇、抑菌、抗病毒、抗腫瘤作用等，是篩選藥物的天然資源寶庫。研究發(fā)現(xiàn)蟒蛇肉酶解肽具有較好的抗氧化能力［8］，本文首次利用ESI-MSn對蟒蛇肉酶解肽進行了分析研究，從中解析出兩個具有代表性的酶解肽的氨基酸序列，為蟒蛇進一步合理開發(fā)應用奠定了基礎。

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