顏 梅，郭俐宏

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000)

激光針刀配合穴位注射威靈仙總皂苷對膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠RF及PGE2的影響

顏 梅，郭俐宏△

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000)

目的:觀察激光針刀配合穴位注射威靈仙總皂苷對膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清類風(fēng)濕因子(RF)及前列腺素E2(PGE2)的影響，探討其作用機(jī)制。方法:大鼠60只，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、激光針刀組、穴位注射組及綜合治療組，除空白對照組外其它4組動(dòng)物于左前側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射弗氏完全佐劑(0.1 ml)造模。在造模成功后，模型組腹腔注射生理鹽水;激光針刀組取左前肢循經(jīng)取穴為主穴激光針刀治療，輔以電針刺激關(guān)元、足三里、脾俞、氣海、陽陵泉、腎俞、肝俞等配穴20 min;穴位注射組于左前側(cè)膝骨關(guān)節(jié)腔內(nèi)每日穴位注射威靈仙總皂苷(50 mg/kg);綜合治療組治療方法為穴位注射組加綜合治療組。以上各組均連續(xù)治療14天。測定動(dòng)物關(guān)節(jié)腔積液中透明質(zhì)酸(HA)、白介素IL－6、前列腺素E2(PGE2)、血清類風(fēng)濕因子(RF)IgM－RF、IgA－RF陽性率，病理檢查關(guān)節(jié)軟骨MMP－1細(xì)胞陽性表達(dá)率。結(jié)果:激光針刀配合穴位注射威靈仙總皂苷顯著降低模型大鼠IL－6、PGE2、IgM－RF、IgA－RF及MMP－1等指標(biāo)，升高HA，與本組治療前、模型組、激光針刀組及穴位注射組比較(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:激光針刀配合穴位注射威靈仙總皂苷能有效治療實(shí)驗(yàn)性大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎，其作用機(jī)制可能為激光針刀松解膝關(guān)節(jié)粘連的炎癥組織，電針刺激激發(fā)經(jīng)氣，威靈仙總皂苷降低IL－6及PGE2等炎性因子刺激，提高關(guān)節(jié)腔內(nèi)HA含量，阻斷類風(fēng)濕因子與抗原IgM、IgA結(jié)合，降低IgM－RF、IgA－RF合成，減輕變態(tài)反應(yīng)發(fā)生而起到協(xié)同治療作用。

激光針刀;威靈仙總皂苷;膝骨關(guān)節(jié)炎;前列腺素E2;類風(fēng)濕因子;穴位注射

威靈仙總皂苷(Total Saponins of Clematis)為毛莨科植物威靈仙(Clematis chinensis osbeck)的干燥根及根莖經(jīng)化學(xué)淬取的滅菌注射液，內(nèi)含威靈仙皂苷元、酚類、黃酮類、常春藤齊墩果酸，具有消炎抑菌、清熱、利尿強(qiáng)心的作用［1］。《本草綱目》記載威靈仙“味微辛咸”，通經(jīng)絡(luò)、消痰涎、祛風(fēng)濕、散癖積，藥性辛散溫通，通行十二經(jīng)脈，既能祛風(fēng)濕，又能通經(jīng)止痹痛［2］。本實(shí)驗(yàn)采取激光針刀配合穴位注射威靈仙總皂苷治療實(shí)驗(yàn)性大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎，以期研究聯(lián)合治療的鎮(zhèn)痛消炎作用機(jī)制，為臨床提供安全可靠的綜合治療方案。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組

SD大鼠48只，體質(zhì)量(200±50)g，雌雄兼用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證:SYXK(鄂)2011－0031，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(鄂)2011－0008。采用隨機(jī)數(shù)字表編號后隨機(jī)分為模型組、激光針刀組、穴位注射組及綜合治療組，每組12只。

1.2 儀器及藥品

弗氏完全佐劑(上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司);SDZ－II型電子針療儀(上海坤弘，型號:SDZII);威靈仙總皂苷，由湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院藥物制劑研究室提供，總皂苷含量在50%以上，用時(shí)以無菌純化水配制成所需濃度的混懸液;生理鹽水。

1.3 造模方法

參照相關(guān)文獻(xiàn)［3］造模方法，備皮消毒:電動(dòng)剃須刀剃掉大鼠左前側(cè)膝關(guān)節(jié)部位及以下鼠毛，皮膚消毒后用1 ml注射器將0.1 ml弗氏完全佐劑注入左前膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)(1、3、7天各1次)，采用超疲勞易提前發(fā)生膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床發(fā)病特點(diǎn)，可每天強(qiáng)制大鼠動(dòng)物活動(dòng)30～60 min，7天后如出現(xiàn)以下與臨床急性膝關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)一致的癥狀時(shí)即可確定造模成功:①左前膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛，同時(shí)軟組織腫脹或積液;②左前膝關(guān)節(jié)及其周圍僵硬、活動(dòng)受限;③左前膝關(guān)節(jié)病理切片鏡檢出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔大量滲出液，軟骨表面粗糙，滑膜增生、粘連、肥厚等膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學(xué)改變;④實(shí)驗(yàn)室左前膝關(guān)節(jié)積液檢查出現(xiàn) IL－1β升高、HA含量降低。

1.4 治療方法

將大鼠固定于大鼠固定器，激光針刀組取痛點(diǎn)循經(jīng)取穴為主穴激光針刀治療，輔以電針刺激關(guān)元、氣海、足三里、陽陵泉、腎俞、脾俞、肝俞等20 min，治療時(shí)以痛點(diǎn)穴位正極，配穴為負(fù)極，接SDZ－Ⅱ型電子針療儀，連續(xù)波，頻率10 Hz，留針20 min。穴位注射組于膝骨關(guān)節(jié)處穴位注射威靈仙總皂苷。綜合治療組先同激光針刀組治療方法，在激光針刀治療及留針20 min并休息60 min后，于左前膝骨關(guān)節(jié)穴位注射威靈仙總皂苷(50 mg/kg)。模型組每日注射生理鹽水1 ml作為對照。以上4組動(dòng)物治療每日1次，7天為1個(gè)療程，治療2個(gè)療程。

1.5 檢驗(yàn)指標(biāo)及方法

參照文獻(xiàn)［4］，于治療前后分別抽取大鼠左前膝關(guān)節(jié)腔積液，測定動(dòng)物關(guān)節(jié)積液中透明質(zhì)酸(HA)、白介素IL－6、前列腺素 E2(PGE2)、血清類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)IgM－RF、IgA－RF陽性率，并病理檢查關(guān)節(jié)軟骨MMP－1細(xì)胞陽性表達(dá)率(陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.6 膝關(guān)節(jié)腫脹百分率的測定

采用玻璃容器排水法測量治療前后左前膝骨關(guān)節(jié)容積，計(jì)算左前膝關(guān)節(jié)腫脹百分率。方法為:先取50 ml量筒，先注入蒸餾水使液面與量筒最高處平齊，用20 ml注射器吸出10 ml蒸餾水。測量時(shí)用記號筆在大鼠左前膝關(guān)節(jié)縫矢狀面做一標(biāo)記，然后把大鼠左前肢緩慢伸入量筒內(nèi)，使標(biāo)記與量筒最高處平齊。移開動(dòng)物后用已吸入20 ml蒸餾水的注射器向量筒內(nèi)緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處平齊，左前膝關(guān)節(jié)容積=20 ml－注射器內(nèi)剩余蒸餾水體，反復(fù)3次取平均值。左前膝關(guān)節(jié)腫脹百分率(%)=(造模后容積－造模前容積)/造模前容積×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 IgA－RF、IgM－RF比較

見表1。模型組IgA－RF、IgM－RF保持在較高水平，說明變態(tài)反應(yīng)嚴(yán)重，造模成功。激光針刀組治療前后無變化，穴位注射組IgA－RF、IgM－RF明顯下降，與激光針刀組及本組治療前比較P＜0.05，綜合治療組降低程度較穴位注射組下降更明顯，與本組治療前、模型組、激光針刀組及穴位注射組比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠IgM－RF、IgA－RF比較 (±s，n=12)

表1 各組大鼠IgM－RF、IgA－RF比較 (±s，n=12)

注:與治療前比較，△P＜0.05;與模型組比較，▲P＜0.05;與激光針刀組比較，#P＜0.05;與穴位注射組比較，*P＜0.05。

組別IgM－RF(%)IgA RF(%)治療前 治療后 治療前 治療后模型組 74.24±7.66 77.57±7.24 66.83±7.19 69.23±6.21激光針刀組 73.21±7.53 70.01±7.15 68.12±7.07 65.89±6.50穴位注射組 71.34±7.61 37.57±3.12△▲ 66.32±7.09 44.23±4.22△▲綜合治療組 72.97±7.52 22.01±2.41△▲#*65.14±7.2132.89±3.54△▲#*

2.2 HA、IL－6比較

見表2。激光針刀組HA有一定的升高、IL－6有降低趨勢，但與模型組及本組治療前比較P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。穴位注射組HA升高、IL－6降低，與激光針刀組及本組治療前比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合治療組較激光針刀組及穴位注射組HA明顯升高、IL－1β明顯降低，與本組治療前、模型組、激光針刀組及穴位注射組比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠HA、IL－6比較 (±s，n=12)

表2 各組大鼠HA、IL－6比較 (±s，n=12)

注:與治療前比較，△P＜0.05;與模型組比較，▲P＜0.05;與激光針刀組比較，#P＜0.05;與穴位注射組比較，*P＜0.05。

組別HA(μg/L)IL－6(pg/ml)治療前 治療后 治療前 治療后模型組1.48±0.22 1.77±0.29 32.28±3.30 30.57±3.11激光針刀組 1.46±0.23 1.69±0.25 30.21±3.51 27.31±2.87穴位注射組 1.44±0.20 0.94±0.08△▲#31.49±3.28 21.34±2.40△▲#綜合治療組 1.47±0.21 0.56±0.04△▲#*33.02±3.1912.30±1.05△▲#*

2.3 MMP－1、PGE2比較

見表3。模型組PGE2及MMP－1均保持在較高水平，與本組治療前比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。激光針刀組PGE2及MMP－1均有一定程度降低，與模型組及本組治療前比較P＜0.05，差異顯著。穴位注射組較激光針刀組降低明顯(P＜0.05)。綜合治療組PGE2及MMP－1降低程度較大，與本組治療前、模型組、激光針刀組及穴位注射組比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組大鼠MMP－1、PGE2比較 (±s，n=12)

表3 各組大鼠MMP－1、PGE2比較 (±s，n=12)

注:與治療前比較，△P＜0.05;與模型組比較，▲P＜0.05;與激光針刀組比較，#P＜0.05;與穴位注射組比較，*P＜0.05。

組別PGE2(OD)MMP－1(%)治療前 治療后 治療前 治療后模型組1.11±0.23 1.10±0.12 19.39±2.05 18.91±2.31激光針刀組 1.07±0.19 0.99±0.10 18.41±2.23 17.34±2.02穴位注射組 1.09±0.12 0.59±0.09△# 20.97±2.12 11.30±1.37△#綜合治療組 1.10±0.10 0.35±0.07△▲#*19.01±2.10 8.42±1.02△▲#*

2.4 各組動(dòng)物足腫脹度、消腫時(shí)間比較

見表4。激光針刀組足腫脹度、消腫時(shí)間均有一定的降低，與模型組及本組治療前比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。穴位注射組與激光針刀組類似，兩組間比較，P＞0.05。綜合治療組則明顯優(yōu)于激光針刀組及穴位注射組，與本組治療前、模型組、激光針刀組及穴位注射組比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 各組大鼠足腫脹度、消腫時(shí)間比較 (±s，n=12)

表4 各組大鼠足腫脹度、消腫時(shí)間比較 (±s，n=12)

注:與治療前比較，△P＜0.05;與模型組比較，▲P＜0.05;與激光針刀組比較，#P＜0.05;與穴位注射組比較，*P＜0.05。

組別 足腫脹度(%)消腫時(shí)間(d)治療前 治療后 治療前 治療后模型組 35.92±3.70 39.21±4.01 13.20±2.35 13.50±1.57激光針刀組 34.41±3.29 26.34±1.41△▲ 13.21±2.51 10.33±1.12△▲穴位注射組 36.29±3.52 24.39±1.33△▲ 12.41±2.20 9.02±1.08△▲綜合治療組 32.29±3.53 10.31±1.21△▲#*13.49±2.13 6.34±0.92△▲#*

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膝骨關(guān)節(jié)炎是由于膝關(guān)節(jié)局部濕濁痹阻及血瘀氣滯而起，歸“骨痹”“筋痹”范疇，治則當(dāng)利濕除痹、舒筋通絡(luò)、活血化瘀、行氣止痛［5］。當(dāng)膝關(guān)節(jié)滑膜受到勞損、外傷、感染等刺激后，滑膜下層毛細(xì)血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管通透性增大，致使關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生大量滲出液，出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液［6］。此類患者常挾濕氣下注于關(guān)節(jié)，腎氣虧損、筋脈不通、經(jīng)絡(luò)瘀阻所致［7］。威靈仙為毛莨科植物威靈仙干燥根及根莖，《本草綱目》記載威靈仙“威言其性猛也，靈仙言其功效”、“味微辛咸”，能通十二經(jīng)脈、消痰涎、祛風(fēng)濕、散癖積［8］。其主要有效成分為常春藤皂苷元及齊墩果酸，具有清熱、消炎抑菌、強(qiáng)心、利尿作用［9］。

膝骨關(guān)節(jié)炎常出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液，其病理改變以炎性浸潤關(guān)節(jié)腔及滑膜并造成關(guān)節(jié)面軟骨被破壞、變性為主，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞類風(fēng)濕因子及IL－6、PGE2等炎性因子侵蝕分解，關(guān)節(jié)腔內(nèi)HA合成代謝紊亂而造成的慢性、退行性關(guān)節(jié)病變［10］。中醫(yī)認(rèn)為，當(dāng)膝關(guān)節(jié)因外傷或其他原因受損傷后，局部關(guān)節(jié)血瘀氣滯，濕濁之氣痹阻于膝，治則當(dāng)針灸以舒筋通絡(luò)、行氣止痛，中藥內(nèi)服外敷以活血化瘀、利濕除痹而達(dá)到臨床治愈的目的［11］。

PGE2是機(jī)體的主要炎癥因子，當(dāng)出現(xiàn)感染時(shí)，PGE2大量產(chǎn)生。正常的關(guān)節(jié)滑液中僅含有微量IL－6，但當(dāng)罹患膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)，IL－6含量則會異常增高。關(guān)節(jié)液中HA是由N－乙酰氨基葡萄糖胺二糖及D－葡萄糖醛酸組成，是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)及滑液的重要組成部分。HA可減少膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)PGE2等炎性介質(zhì)的合成及擴(kuò)散，減少滑膜的通透性及關(guān)節(jié)內(nèi)滲液［12］。90%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者病理及實(shí)驗(yàn)室檢查ESR、IgM－RF、IgA－RF陽性率有不同程度的增高，BMPs下降的現(xiàn)象［13］。正常關(guān)節(jié)軟骨中MMP－1細(xì)胞陽性表達(dá)極低，在膝骨關(guān)節(jié)炎早期常出現(xiàn)關(guān)節(jié)滑液IL－1β、PGE2及MMP－1細(xì)胞陽性表達(dá)率升高、HA降低的現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)中取痛點(diǎn)循經(jīng)取穴為主穴激光針刀治療，可起到鎮(zhèn)痛消炎的作用，輔以電針刺激關(guān)元、氣海、足三里、陽陵泉、腎俞、脾俞、肝俞等20 min，是因?yàn)殛柫耆蓮?qiáng)筋祛濕，主治膝痹;足三里具有養(yǎng)血益氣之功效，主治下肢痿痹;而血海穴主活血，與陽陵泉及足三里配伍具有舒筋活絡(luò)、利通關(guān)節(jié)之奇效［14］。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，綜合治療組大鼠治療后MMP－1細(xì)胞陽性表達(dá)率、PGE2、消腫時(shí)間、足腫脹度呈不同程度降低，這可能與電針刺激關(guān)元、氣海、足三里、陽陵泉、腎俞、脾俞、肝俞等穴位激發(fā)經(jīng)氣，促進(jìn)局部血液循環(huán)、增強(qiáng)病變組織新陳代謝、降低痛閾、減輕關(guān)節(jié)滑膜表面神經(jīng)神經(jīng)末梢對炎性因子IL－6、PGE2刺激有關(guān)［15］。結(jié)果與周效思等研究［16］威靈仙能明顯延長小鼠熱板痛閾時(shí)間和顯著減少小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)相吻合。綜合治療組大鼠在注射威靈仙注射液治療后，HA較單用激光針刀及穴位注射增高更明顯，IL－6、PGE2及MMP－1進(jìn)一步下降，這應(yīng)與威靈仙穴位注射促使滑膜內(nèi)襯B型滑膜細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞大量分泌HA有關(guān)，達(dá)到潤滑關(guān)節(jié)、延緩軟骨退變及保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用［17］。IgA－RF、ESR、IgM－RF下降可能與穴位注射威靈仙吸收后炎癥因子的刺激及滑膜的通透性均降低有關(guān)，故病理檢查MMP－1細(xì)胞陽性表達(dá)下降。同時(shí)，威靈仙總皂苷可能抑制了機(jī)體產(chǎn)生過多的IL－6及PGE2等炎癥因子，降低滑膜的通透性及因炎癥刺激而造成MMP－1細(xì)胞陽性表達(dá)，這對減輕IL－6及PGE2等對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的破壞、減少關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性滲出液及炎性反應(yīng)起到至關(guān)重要的作用。

總之，通過激光針刀配合穴位注射威靈仙總皂苷聯(lián)合治療，可降低大鼠痛閾，促進(jìn)大鼠關(guān)節(jié)腔血液及淋巴循環(huán)及炎癥吸收，清除關(guān)節(jié)腔內(nèi)IL－6、PGE2等炎性因子，抑制類風(fēng)濕因子產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)，起到祛風(fēng)除濕、活血化瘀、消腫鎮(zhèn)痛作用，進(jìn)而改善關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境而達(dá)“通則不痛”的功效。

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Effect of Total Saponins of Laser Knife Combined with Acupoint Injection of Radix Clematidis on RF and PGE2of Model Rats with Knee Osteoarthritis

YAN Mei，GUO Li－h(huán)ong△
(Shiyan Taihe Hospital，Affiliated Hospital of Hubei Medical College，Shiyan442000，China)

Objective:Establishing the experimental operation for model rats with knee osteoarthritis，to observe the effect of laser needle knife combined with acupoint injection of Radix Clematidis saponins on serum rheumatoid factor(RF)RA and PGE2，and to investigate its mechanism of action.Methods:60 rats were randomly divided into a blank control group，a model group，a laser acupuncture group，an acupoint injection group and a combined treatment group，except the blank control group in other four groups animals

the left knee joint cavity injection of Freund＇s complete adjuvant(0.1 ml).After the success of modeling，the model group was injected with saline;laser needle knife group received electroacupuncture combined with laser needle knife treatment，electroacupuncturing at Guanyuan，Zusanli，Pishu，Qihai，Yanglingquan，Shenshu，Ganshu for 20 min;the acupoint injection group received the left knee joint cavity acupoint injection(50mg/kg);comprehensive treatment method was used for acupoint injection group and combined treatment group;each group was treated for 14 days.Determine animal articular effusion of hyaluronic acid(HA)and interleukin 6 IL－and prostaglandin E2(PGE2)，serum rheumatoid factor(rheumatoid，factor，RF)IgM－RF，IgA－RF positive rate，the positive expression rate of MMP－1 cells in pathological articular cartilage.Results:The laser knifecombined with acupoint injection of Radix Clematidis saponins could significantly decrease the IL－6，PGE2，IgM－RF，IgA－RF and could MMP－1 and increase HA.Compared with the model group，the laser needle knife group and acupoint injection group had a significant difference(P＜0.05).Conclusion:Laser knife combined with acupoint injection of Radix Clematidis saponins can be effective in the treatment of rats with knee osteoarthritis，and its mechanism may be related to the laser acupotomy knee joint adhesion in inflammation tissue，electroacupuncture stimulation，reduction of IL－6 and PGE2and other inflammatory factors stimulation，increase of HA content in articular cavity.Prevent rheumatoid factor from binding with antigen IgM and IgA，and decrease the combination of IgM－RF and IgA－RF，reduce the occurrence of allergic reactions and play a synergistic effect.

Laser needle knife;Total saponins of Radix Clematidis;Knee osteoarthritis;PGE2;Rheumatoid factors;Acupoint injection

R246.2

A

1005－0779(2015)12－0071－04

顏梅(1967－)，女，主管護(hù)師，主要從事臨床中藥藥理及內(nèi)分泌疾病護(hù)理工作。

△通訊作者:郭俐宏(1972－)，女，副主任護(hù)師，主要從事臨床中藥藥理及康復(fù)護(hù)理工作。

2015－06－30