武俊瑞，王曉蕊，唐筱揚(yáng)，王茜茜，烏日娜,2,*，岳喜慶

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬是以大豆為原料，經(jīng)過煮制、擠壓成塊、制曲、發(fā)酵而成，在制曲和發(fā)酵過程中，利用原料和環(huán)境中的微生物自然發(fā)酵，微生物利用蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等大分子物質(zhì)分解成為小分子的風(fēng)味物質(zhì)，使豆醬的pH值和各種養(yǎng)分發(fā)生變化[1-5]。由于其良好的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值廣受人們歡迎。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中含有異黃酮類、多酚類、大豆皂苷、類黑精、肽類、維生素等大量對(duì)人體有益的生理活性物質(zhì)，具有很好的保健功能[3,5-7]。

豆醬中微生物的種類繁多，包括乳酸菌、酵母菌、霉菌等。乳酸菌是豆醬呈味的主要微生物，可將精氨酸、酪氨酸、組氨酸及天冬氨酸分解，同時(shí)對(duì)絲氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸等進(jìn)行特異性脫羧基作用，左右著醬的香氣[8-10]。酵母菌在豆醬發(fā)酵過程中主要起著發(fā)酵糖類產(chǎn)酸和產(chǎn)生醇類的作用[11-12]。另外乳酸菌與酵母菌協(xié)同作用，乳酸和乙醇生成乳酸乙酯，和魯氏酵母生成糠醇，從而產(chǎn)生獨(dú)特的醬香氣。同時(shí)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸使得體系pH值降低，有利于酵母菌的增殖，而酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的大量乙醇卻會(huì)制約著乳酸菌的繁殖[13]。乳酸菌和酵母菌在豆醬發(fā)酵中相互協(xié)同也相互影響。

本研究以采自遼寧地區(qū)的38份傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品為實(shí)驗(yàn)材料，從豆醬中分離出乳酸菌和酵母菌疑似菌株，再利用16S rDNA序列分析方法和26S rDNA D1/D2序列同源性分析，對(duì)其進(jìn)行鑒定并保藏，為進(jìn)一步開發(fā)利用豆醬中乳酸菌和酵母菌資源提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從遼寧省地區(qū)傳統(tǒng)手工制醬農(nóng)家采集豆醬樣品38份，見表1。

表1 樣品采集結(jié)果Table1 Geographic sources of samples collected for this study

1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基 本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 上海桑尼生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

JNOEC XS-212-201生物顯微鏡 日本Olympus公司；5804R型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；SHP-1500型低溫生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；2720型Thermal Cycler PCR儀 美國ABI公司；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng) 中國天能公司；ND-1000型微量紫外分光光度計(jì) 美國Nano Drop公司。

1.4 乳酸菌分離鑒定及其多樣性分析

1.4.1 乳酸菌的分離純化與保存

采用傾注培養(yǎng)法，將豆醬樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋后，取10－4～10－7的樣品稀釋液100 μL于平板中，倒入含有CaCO3的滅菌MRS瓊脂培養(yǎng)基20 mL，混合均勻并凝固后，于30℃培養(yǎng)24～48 h。挑取有鈣圈的單菌落，在滅菌后的MRS固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離，置于30℃培養(yǎng)24～48 h，確定為單菌落后置于10倍放大鏡下進(jìn)行菌落形態(tài)學(xué)觀察，并且進(jìn)行革蘭氏染色，于100倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行菌體形態(tài)學(xué)觀察，并記錄[14-16]。最后用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行穿刺保藏。

1.4.2 利用16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定

1.4.2.1 總DNA的提取及純度的檢測(cè)

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取供試菌株基因組DNA[17-18]。使用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的濃度以及OD260nm/OD280nm比值，再用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增16S rDNA序列

16S rDNA 擴(kuò)增引物：正向引物為27f：5’-AGAGTTT G A T C C T G G C T C A G-3’；反向引物為1 4 9 5 r：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：上下游引物各1 μL（10 pmol/μL），模板DNA（100 ng/μL）1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，超純水17.2 μL，rTaq酶0.3 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min，4℃保溫[19-20]。

1.4.2.3 檢測(cè)16S rDNA擴(kuò)增片段及測(cè)序

取3 μL的PCR產(chǎn)物與1 μL的6×Loading Buffer混合，加入1%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，在電壓為5 V/cm，電泳液為0.5×TBE（Tris硼酸）中電泳。電泳結(jié)束后，用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）進(jìn)行染色，染色30 min，將膠板置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。PCR產(chǎn)物檢測(cè)后，片段長(zhǎng)度約為1 500 bp的陽性產(chǎn)物直接送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定[21-22]。

1.4.2.4 乳酸菌同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部相似性比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對(duì)分析，運(yùn)用Mega4.0軟件的相鄰計(jì)算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判定目的菌的分類地位或它的系統(tǒng)發(fā)育地位[18,21]。

1.5 酵母菌分離鑒定及其多樣性分析

1.5.1 酵母菌的分離純化與保存

將豆醬樣品進(jìn)行梯度稀釋，取10－4～10－7的樣品稀釋液100 μL，均勻涂布在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48 h。挑取與酵母菌菌落形態(tài)相符的單個(gè)菌落，接于PDA液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24 h。傳至二代，用平板劃線的方法，接種于PDA瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48 h[23-24]。挑取培養(yǎng)好的平板上分離出的單菌落，接于PDA液體培養(yǎng)基中依上述純化過程再次純化兩代。用接種環(huán)挑取純化過的二代菌種，以劃線的方式保藏于PDA固體斜面上，25℃培養(yǎng)48 h。

1.5.2 酵母菌26S rDNA D1/D2序列同源性分析

1.5.2.1 酵母菌總DNA的提取和純度檢測(cè)

采用酵母基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）對(duì)酵母菌總DNA進(jìn)行提取。使用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的濃度和OD260nm/OD280nm比值，用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)基因組DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.5.2.2 PCR擴(kuò)增26S rDNA D1/D2序列

26S rDNA D1/D2擴(kuò)增引物：正向引物為NL1-FA：5’-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAGCATATCAATA AGCGGAGGAAAAG-3’；反向引物為NL4-RA：5’-AG CGGATCACTTCACACAGGAGGTCCGTGTTTCAAG ACGG-3’。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）：上下游引物各1 μL（10 pmol/μL），模板 DNA（100 ng/μL）1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，4×dNTP Mix 1 μL，超純水40 μL，rTaq酶1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 20 s，循環(huán)36次；72℃延伸8 min，4℃保溫[23-26]。

1.5.2.3 檢測(cè)26S rDNA D1/D2擴(kuò)增片段及測(cè)序

取2 μL的PCR產(chǎn)物與1 μL的6×Loading Buffer混合，加入1%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，在電壓為5 V/cm，電泳液為0.5×TBE中電泳。電泳結(jié)束后，用EB進(jìn)行染色，染色30 min，將膠板置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。PCR產(chǎn)物檢測(cè)后，將片段長(zhǎng)度約為600 bp的陽性產(chǎn)物直接送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5.2.4 酵母菌同源性分析

將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析[25-26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆醬中乳酸菌的分離與鑒定

2.1.1 乳酸菌的表型特征

本實(shí)驗(yàn)共從豆醬樣品中分離出62株乳酸菌，其中有28株球菌（45.2%），34株桿菌（54.8%）。在MRS固體培養(yǎng)基中，菌落形態(tài)為乳白色或透明且表面光滑的圓形菌落。菌落直徑集中在0.5～1.5 mm。革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)62株菌均為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)分為球狀和桿狀，排列方式為單個(gè)、成對(duì)或短鏈。

2.1.2 乳酸菌總DNA的提取及16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)

圖1 部分菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 16S rDNA PCR products from lactic acid bacteria

圖1所示為部分菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，可以觀察到所有泳道的1 500 bp左右位置均出現(xiàn)了一條亮帶，并且無明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，符合測(cè)序要求。將PCR片段長(zhǎng)度在1 500 bp左右的陽性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。

2.1.3 乳酸菌16S rDNA同源性分析

將62株乳酸菌16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果同國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。結(jié)果如表2所示。

表2 乳酸菌16S rDNA序列分析結(jié)果Table2 Results of 16S rDNA sequence analysis for 62 LAB strains

由表2可知，DD1-2等19株菌與Lactobacillus plantarum KJ026699.1的同源性達(dá)到99%或100%，所以將其鑒定為L(zhǎng).plantarum；DD2-1等14株與Enterococcus faecium FJ972173.1的同源性達(dá)到99%或100%，所以將其鑒定為E.faecium；DD1-1等12株菌與Tetragenococcus halophilus FJ715470.1的同源性達(dá)到99%或100%，所以將其鑒定為T.halophilus；DD2-2等11株菌與Lactobacillus sakei EU626014的同源性達(dá)到99%或100%，所以將其鑒定為L(zhǎng).sakei；SY1-1等4株菌與Lactobacillus fermentum EF371900.1的同源性達(dá)到99%或100%，所以將其鑒定為L(zhǎng).fermentum；DL1-1與DL3-2與Pediococcus pentosaceus AJ305321的同源性達(dá)到99%或100%，所以將其鑒定為P.pentosaceu。

本研究從遼寧省14個(gè)地區(qū)采集到的38份樣品中共分離出了62株乳酸菌，通過16S rDNA序列分析后共鑒定出6個(gè)種，L.plantarum19株，是樣品中分離數(shù)量最多的菌種，除錦州和鞍山外均分離到該菌株，占總數(shù)的30.65%；E.faecium有14株，除盤錦、錦州和遼陽外均分離到該菌株，占總數(shù)的22.58%；T.halophilus有12株，占總數(shù)的19.35%；分離到L.sakei 11株，占總數(shù)的17.74%。另外，還分離到4株L.fermentum和2株P(guān).pentosaceus，這2株P(guān).pentosaceus均分離自大連樣品。14個(gè)地區(qū)中，有85.71%的地區(qū)都分離到了L.plantarum，78.57%的地區(qū)分離到了E.faecium，有71.43%的地區(qū)分離到了T.halophilus，可初步推測(cè)這3種菌為遼寧省地區(qū)自然發(fā)酵豆醬中存在的優(yōu)勢(shì)菌。

2.1.4 豆醬樣品中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)同源序列的搜索結(jié)果，下載相關(guān)模式株的序列，利用本地軟件Mega4.0將測(cè)得序列與GenBank中的模式菌株16S rDNA序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），獲得目的菌的分類地位和它的系統(tǒng)發(fā)育地位。

圖2 部分乳酸菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria

從系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）可以看出，Lactobacillus sakei SY3-1形成了第一群，Lactobacillus plantarum BX2-2和Lactobacillus fermentum CY1-1的16S rDNA序列在進(jìn)化關(guān)系上親緣關(guān)系較近，形成了第二類群；Tetragenococcus halophilus FS2-2和Enterococcus faecium DD2-1形成了第三類群，所有分離株與相對(duì)應(yīng)的參考菌株同源性都達(dá)到了99%以上，并與其聚在一起，證明乳酸菌16S rDNA區(qū)域序列分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.1.5 豆醬樣品乳酸菌生物多樣性分析

本研究從遼寧省14個(gè)地區(qū)38份樣品中共分離到6個(gè)種62株乳酸菌，其中乳球菌為3個(gè)種28株（45.16%），乳桿菌3個(gè)種34株（54.84%），表3匯總了每個(gè)種的乳酸菌的地區(qū)分布情況。

表3 各地區(qū)豆醬樣品中乳酸菌分離鑒定情況Table3 Distribution of lactic acid bacteria in fermented soybean paste from different regions

由表3可知，從丹東市采集的3個(gè)樣品中共分離到4個(gè)種（占種數(shù)的66.67%）5株乳酸菌（占總菌數(shù)的8.06%）；盤錦市采集的2個(gè)樣品中分離出乳酸菌3個(gè)種（占種數(shù)的50%）3株（占總菌數(shù)的4.83%）；葫蘆島市的3個(gè)樣品中分離出乳酸菌4個(gè)種（占種數(shù)的66.67%）5株（占總菌數(shù)的8.06%）；來自阜新市的3個(gè)樣品中分離出4個(gè)種（占種數(shù)的66.67%）乳酸菌6株（占總菌數(shù)的9.68%）；沈陽市的5份樣品中分離出乳酸菌5個(gè)種（占種數(shù)的83.33%）8株（占總菌數(shù)的12.9%）；朝陽市的3份樣品中分離出乳酸菌4個(gè)種（占種數(shù)的66.67%）乳酸菌4株（占總菌數(shù)的6.45%）；撫順市的4份樣品中分離出乳酸菌4個(gè)種（占種數(shù)的66.67%）乳酸菌7株（占總菌數(shù)的11.29%）；本溪市的2份樣品中分離出乳酸菌3個(gè)種（占種數(shù)的50%）乳酸菌4株（占總菌數(shù)的6.45%）；來自錦州市的2個(gè)樣品中分離到乳酸菌2個(gè)種（占種數(shù)的33.33%）2株乳酸菌（占總菌數(shù)的3.23%）；大連市采集的3個(gè)樣品中分離出4個(gè)種（占種數(shù)的66.67%）乳酸菌5株（占總菌數(shù)的8.06%）；遼陽市采集的2個(gè)樣品中分離出3個(gè)種（占種數(shù)的50%）乳酸菌5株（占總菌數(shù)的8.06%）；鞍山市采集的2個(gè)樣品中分離出乳酸菌2個(gè)種（占種數(shù)的33.33%）2株（占總菌數(shù)的3.23%）；營口市采集的3個(gè)樣品中分離出乳酸菌2個(gè)種（占種數(shù)的33.33%）4株（占總菌數(shù)的6.45%）；鐵嶺市采集的1個(gè)樣品中分離出乳酸菌2個(gè)種（占種數(shù)的33.33%）2株（占總菌數(shù)的3.23%）。

2.2 酵母菌分離鑒定及多樣性分析

2.2.1 酵母菌的表型特征

實(shí)驗(yàn)共從豆醬樣品中分離出56株酵母菌。在PDA固體培養(yǎng)基中，菌落顏色為乳白色或奶油色，表面光滑，呈圓形或卵圓形。菌落大而厚，直徑大于3 mm。

2.2.2 酵母菌總DNA的提取及26S rDNA D1/D2擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)

圖3為部分菌株26S rDNA D1/D2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，所有泳道的600 bp左右位置均出現(xiàn)了一條亮帶，并且無明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，符合測(cè)序要求。將PCR片段長(zhǎng)度在600 bp左右的陽性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。

圖3 部分菌株26S rDNA D1/D2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 26S rDNA D1/D2 PCR products from yeast

2.2.3 酵母菌26S rDNA D1/D2同源性分析

將56株酵母菌26S rDNA D1/D2擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果同NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。結(jié)果如表4所示。

表4 酵母菌26S rDNA D1/D2序列分析結(jié)果Table4 Results of 26S rDNA D1/D2 sequence analysis for yeast

通過在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比分析（表4），SY2等18株菌被鑒定為Zygosaccharomyces；SY1-B等13株被鑒定為Candida；SY1-A等14株菌被鑒定為C.parapsilosis；SY3-A等7株菌被鑒定為D.hansenii；BX1-B等4株菌被鑒定為Debaryomyces。

本研究從遼寧省14個(gè)地區(qū)采集到的38份樣品中共分離出了56株酵母菌，通過26S rDNA D1/D2序列分析后共鑒定出5個(gè)種，Zygosaccharomyces18株，是樣品中分離數(shù)量最多的菌種，占總數(shù)的32.14%；Candida 13株，占總數(shù)的23.21%；C.parapsilosis 14株，占總數(shù)的25%；分離到D.hansenii 7株，占總數(shù)的12.5%。還分離到4株Debaryomyces，分別來自本溪、撫順、遼陽、營口。14個(gè)地區(qū)中，有34.21%的地區(qū)都分離到了Zygosaccharomyces和C.parapsilosis，26.32%的地區(qū)分離到了Candida，可初步推測(cè)這3種菌為遼寧省自然發(fā)酵豆醬中存在的優(yōu)勢(shì)菌。

2.2.4 豆醬樣品酵母菌生物多樣性分析

本研究從遼寧省14個(gè)地區(qū)38份樣品中共分離到5個(gè)種56株酵母菌，表5匯總了每個(gè)種的酵母菌的地區(qū)分布情況。

表5 各地區(qū)豆醬樣品中酵母菌分離鑒定情況Table5 Distribution of yeast in fermented soybean paste from different regions

由表5可知，從阜新市采集的3個(gè)樣品中共分離到4個(gè)種（占種數(shù)的80%）6株酵母菌（占總菌數(shù)的10.71%）；沈陽市采集的5個(gè)樣品中分離出酵母菌4個(gè)種（占種數(shù)的80%）7株（占總菌數(shù)的12.5%）；大連市的3個(gè)樣品中分離出酵母菌4個(gè)種（占種數(shù)的80%）4株（占總菌數(shù)的7.14%）；來自鞍山市的2個(gè)樣品中分離出4個(gè)種（占種數(shù)的80%）乳酸菌4株（占總菌數(shù)的7.14%）；營口市的3份樣品中分離出酵母菌4個(gè)種（占種數(shù)的80%）4株（占總菌數(shù)的7.14%）。由此可見，遼寧省阜新市和沈陽市自然發(fā)酵豆醬中酵母菌多樣性較好。

3 結(jié) 論

本研究從遼寧省14個(gè)地區(qū)38份樣品中共分離到乳酸菌62株，并用乳酸菌16S rDNA序列分析法對(duì)分離到的乳酸菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為L(zhǎng).plantarum 19株、E.faecium 14株、T.halophilus 12株、L.sakei 11株、L.fermentum 4株、P.pentosaceus 2株。分離到酵母菌56株，經(jīng)過26S rDNA D1/D2序列分析方法鑒定結(jié)果為Zygosaccharomyces 18株、Candida 13株、C.parapsilosis 14株、D.hansenii 7株、Debaryomyces 4株。

14個(gè)地區(qū)中，有85.71%的地區(qū)都分離到了L.plantarum；78.57%的地區(qū)分離到了E.faecium；有71.43%的地區(qū)分離到了T.halophilus，可初步推測(cè)這3種菌為遼寧省自然發(fā)酵豆醬中存在的優(yōu)勢(shì)菌。14個(gè)地區(qū)中，有34.21%的地區(qū)都分離到了Zygosaccharomyces和C.parapsilosis，26.32%的地區(qū)分離到了Candida，可初步推測(cè)這3種菌為遼寧省自然發(fā)酵豆醬中存在的優(yōu)勢(shì)菌。

丹東市、沈陽市、阜新市等地區(qū)的樣品中乳酸菌的多樣性較好，而營口市和鐵嶺市均發(fā)現(xiàn)2種乳酸菌，多樣性較差。遼寧省阜新市和沈陽市自然發(fā)酵豆醬中酵母菌多樣性較好。

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