歐陽(yáng)遜，劉松梁，姚明明，曾 潔，張廣吉

(中國(guó)桂林昊旺生物科技有限公司科研中心，廣西 桂林 541000)

安全、低毒、低殘留、高效、方便和經(jīng)濟(jì)等是農(nóng)藥生產(chǎn)的基本原則，這些原則是農(nóng)藥和農(nóng)業(yè)發(fā)展的基本要求，也是當(dāng)今人們對(duì)環(huán)境友好生產(chǎn)的訴求[1]，滿足這些要求當(dāng)推生物農(nóng)藥。ZR-型保幼激素即是一種典型生物農(nóng)藥，不僅是一種具備保幼激素活性的高效昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，而且生物活性和穩(wěn)定性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然保幼激素[2-4]。其中ZR-515是廣西昊旺生物科技有限公司主打產(chǎn)品，于2014年12月建成投產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了國(guó)內(nèi)首家工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)保幼激素類似物烯蟲(chóng)酯（11-甲氧基-3,7,11-三甲基-2E，4E-十二烯酸異丙酯）。

作為農(nóng)藥原藥，投放市場(chǎng)前須辦理農(nóng)藥登記，辦理農(nóng)藥登記需提供一定數(shù)量高純的烯蟲(chóng)酯（＞98%），以及原藥中存在的雜質(zhì)成分確認(rèn)。目前車間生產(chǎn)的烯蟲(chóng)酯含量在92%左右，僅在合格范圍內(nèi)，與高純?cè)幒坑休^大差距，需通過(guò)一定手段純化方能取得。

鑒于烯蟲(chóng)酯性黏，飽和蒸氣壓低，同時(shí)對(duì)溫度敏感，不宜用蒸餾除去可能存在的雜質(zhì)；同時(shí)可能存在的雜質(zhì)分子量與烯蟲(chóng)酯分子量比較接近，也不適合分子蒸餾法提純；比較可行的純化方法有高效液相制備及提純。但據(jù)相關(guān)單位信息，提純100g費(fèi)用4～5萬(wàn)，是一筆不小的費(fèi)用。本公司科研中心實(shí)驗(yàn)室通過(guò)一段時(shí)間摸索，采用柱層析方法進(jìn)行分離提純，制得高純烯蟲(chóng)酯。

1 儀器和試劑

福立氣相色譜儀（9790Ⅱ），島津液相色譜儀，玻璃層析柱（30mm×400mm），柱層析硅膠（0.038～0.049mm），三用紫外分析儀，硅膠板（50mm×100mm），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

正己烷（95%），丙酮（AR），癸二酸二丁酯（GD），甲醇（GR），烯蟲(chóng)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品（＞99%），烯蟲(chóng)酯（87% ～93%）。

2 烯蟲(chóng)酯的含量測(cè)定分析

烯蟲(chóng)酯含量測(cè)定普遍使用氣相色譜和高效液相色譜分析[5-6]，本研究采用氣相色譜與液相色譜結(jié)合分析烯蟲(chóng)酯含量[7]。

2.1 氣相色譜分析

2.1.1 儀器

氣相色譜儀：氫火焰離子化檢測(cè)器，氣相工作站。色譜柱：OV-1701，30m×0.32mm×0.5μm毛細(xì)管柱。微量進(jìn)樣器：10μL。

2.1.2 氣相色譜條件

溫度：柱室240℃，汽化室270℃，檢測(cè)室270℃。

氣體流量：載氣 (N2) 30 mL?min-1，H230mL·min-1，Air 300 mL·min-1。

進(jìn)樣量：1.0μL；保留時(shí)間：烯蟲(chóng)酯約5.2min，內(nèi)標(biāo)物約6.3min，參見(jiàn)圖1。

2.1.3 測(cè)定步驟

2.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

圖1 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定烯蟲(chóng)酯出峰情況

稱取烯蟲(chóng)酯標(biāo)準(zhǔn)樣一定量（精確至 0.0002g），置于10mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入2.0mL內(nèi)標(biāo)物（癸二酸二丁酯），用丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.1.3.2 試樣溶液的配制

稱取烯蟲(chóng)酯與標(biāo)準(zhǔn)樣相同的量（精確至0.0002g），按2.1.3.1同法操作。

2.1.3.3 測(cè)定

分別取標(biāo)準(zhǔn)樣溶液進(jìn)樣3次和試樣溶液進(jìn)樣2次測(cè)定。

2.1.3.4 計(jì)算

由測(cè)得的3次標(biāo)準(zhǔn)樣烯蟲(chóng)酯與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比計(jì)算平均值，同時(shí)測(cè)2次試樣烯蟲(chóng)酯與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比，計(jì)算平均值，按下式計(jì)算烯蟲(chóng)酯含量X。

式中：r1為標(biāo)準(zhǔn)樣烯蟲(chóng)酯與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比算平均值；r2為試樣烯蟲(chóng)酯與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比算平均值； m1為標(biāo)準(zhǔn)樣烯蟲(chóng)酯質(zhì)量；m2為試樣烯蟲(chóng)酯質(zhì)量； w1為標(biāo)準(zhǔn)樣烯蟲(chóng)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

平行測(cè)定2次試樣，結(jié)果允許誤差不大于1.5%。

2.2 高效液相色譜分析

2.2.1 儀器

色譜柱：C18，5μm，150mm×4.6mm；流動(dòng)相：流速 1.0mL·min-1， V甲醇/V水= 85/15；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；柱溫：35℃ ；進(jìn)樣量： 4.6μL。

2.2.2 測(cè)定步驟

取一定量標(biāo)準(zhǔn)樣烯蟲(chóng)酯溶解于100mL容量瓶中，從中取5mL用甲醇稀釋到50mL，同法配制試樣烯蟲(chóng)酯溶液。在相同條件下各平行進(jìn)樣2次，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)樣積分面積A標(biāo)樣和試樣的積分面積A試樣，取平均值。

2.2.3 計(jì)算

式中：A試樣為試樣的面積；A標(biāo)樣為標(biāo)準(zhǔn)樣的面積；m試樣為試樣的質(zhì)量，g；m標(biāo)樣為標(biāo)準(zhǔn)樣的質(zhì)量，g；p為標(biāo)準(zhǔn)樣的含量，%；n為試樣溶液的稀釋倍數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)樣溶液的稀釋倍數(shù)比。

平行2次測(cè)得結(jié)果面積的絕對(duì)誤差小于0.5%.

3 烯蟲(chóng)酯的定性分析

高效液相色譜對(duì)烯蟲(chóng)酯檢測(cè)的靈敏性可用于其定性分析，分析操作可按照2.2的步驟進(jìn)行，從而可判斷烯蟲(chóng)酯可能存在的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，具體見(jiàn)圖2、圖3、圖4。

圖2 烯蟲(chóng)酯標(biāo)樣液相圖譜

圖3 純化烯蟲(chóng)酯（99.22%）圖譜

圖4 烯蟲(chóng)酯原樣（88%）圖譜

從以上3個(gè)圖譜可看出，經(jīng)純化后烯蟲(chóng)酯3.605min處的雜質(zhì)基本去除，9.322min的雜質(zhì)去除，12.279min處和1.756min處的雜質(zhì)仍然存在（參見(jiàn)圖3），但含量變少。

4 烯蟲(chóng)酯的純化

鑒于烯蟲(chóng)酯作原藥登記需提供一定量的高純烯蟲(chóng)酯，而且還可部分用于企業(yè)內(nèi)部用作參考標(biāo)樣，因此有必要摸清烯蟲(chóng)酯的純化處理?xiàng)l件。鑒于烯蟲(chóng)酯黏性大，飽和蒸氣壓低，僅通過(guò)分相、水洗和減壓蒸餾不能去除雜質(zhì)，需另辟途徑方可實(shí)現(xiàn)純化，于是采用了柱層析純化。

4.1 硅膠板層析實(shí)驗(yàn)

為了摸準(zhǔn)洗脫條件，用硅膠板做層析實(shí)驗(yàn)，使Rf差值在0.2左右，從而分離烯蟲(chóng)酯中雜質(zhì)。經(jīng)試驗(yàn)，分別以正己烷與丙酮、乙酸乙酯與丙酮混合液作流動(dòng)相，烯蟲(chóng)酯原樣、雜質(zhì)Rf情況見(jiàn)圖4～圖8（圖中A為烯蟲(chóng)酯、B、C為雜質(zhì)）。

圖4 正己烷∶丙酮100∶0.8烯蟲(chóng)酯原樣的薄層層析圖

圖5 正己烷∶丙酮100∶1烯蟲(chóng)酯原樣的薄層層析圖

圖6 正己烷∶丙酮100∶1.2烯蟲(chóng)酯原樣的薄層層析圖

圖7 乙酸乙酯∶丙酮100∶0.8烯蟲(chóng)酯原樣的薄層層析圖

圖8 乙酸乙酯∶丙酮100∶1烯蟲(chóng)酯原樣的薄層層析圖

當(dāng)用乙酸乙酯和丙酮作溶劑時(shí)，烯蟲(chóng)酯、雜質(zhì)A、B都接近溶劑線，不能分離，而極性最大的雜質(zhì)已離開(kāi)點(diǎn)樣線(見(jiàn)圖7、圖8)。最后以V正/V丙：100/1～100/2正己烷丙酮混合液作洗脫液。

4.2 柱層析

層析柱：30mm×400mm；層析硅膠：0.038～0.049mm；硅膠裝填高度：27～30cm； 上樣量：4～6g；流動(dòng)相：正己烷丙酮混合液；檢測(cè)：三用紫外分析儀。

4.2.1 定性分析

收集不同洗脫段的烯蟲(chóng)酯溶液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓脫除溶劑后，洗脫液前段、中后段的硅膠板層析圖見(jiàn)圖9。

圖9 烯蟲(chóng)酯原樣、層析前段和中后段的薄層層析情況

結(jié)果表明，宜采集洗脫中后段濃縮液，并用液相對(duì)洗脫液中段的濃縮液進(jìn)行定性分析，結(jié)果見(jiàn)圖3、4及表1。發(fā)現(xiàn)經(jīng)純化后，個(gè)別雜質(zhì)峰已消失，部分雜質(zhì)峰明顯減少，達(dá)到純化效果。

表1 烯蟲(chóng)酯純化前后雜質(zhì)峰變化情況

4.2.2 定量分析

濃縮液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓脫除溶劑后，對(duì)收集的中后段烯蟲(chóng)酯用氣相色譜作定量分析，結(jié)果見(jiàn)表2。說(shuō)明柱層析可純化烯蟲(chóng)酯，得到高純度的烯蟲(chóng)酯，并且發(fā)現(xiàn)與烯蟲(chóng)酯原樣濃度關(guān)系不大。

表2 烯蟲(chóng)酯純化前后的含量

5 潛在的經(jīng)濟(jì)效益

根據(jù)目前的分離技術(shù)，使用比較先進(jìn)的高效液相色譜制備機(jī)純化烯蟲(chóng)酯，費(fèi)用4～5萬(wàn)元·(100g)-1，處理耗費(fèi)色譜純?nèi)軇?00L·(100g)-1左右，溶劑的后續(xù)處理將是一筆不小的費(fèi)用。使用柱層析分離提純，柱層析純化成本1.6萬(wàn)元·(100g)-1。主要溶劑正己烷可部分回收，如提純的烯蟲(chóng)酯能部分轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品，產(chǎn)生的效益參見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)室用柱層析法分離提純烯蟲(chóng)酯是一種可行、實(shí)用、見(jiàn)效快的方法。

表3 柱層析純化烯蟲(chóng)酯費(fèi)用核算

[1] 黎金嘉.農(nóng)藥液體制劑配方設(shè)計(jì)參考[J].農(nóng)藥市場(chǎng)信息，2007(13)：4-6.

[2] 金人憲，楊育華.ZR-型保幼激素類似物合成工藝研究[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2007(1)：15-17．

[3] Amanda S.Hill,Joanne V.Mei,Chih-MingYin, Bruce S, et al.Determination of the Insect Growth Regulator Methoprone in Wheat Grain and Milling Fractions Using an Enzyme immunoassay[J]. Agric.Food chem., 1991(39): 1882-1886.

[4] Joanne V. Mei, Chih-Ming Yin, Louis A, Corpino, et al.Hapten Synthesis and Development of immunoassays for Methoprene[J]. Agric. Food chem., 1991(39): 2083-2090.

[5] Robert A. Heckman, Bruce S. Ferguson, Titan S. Fan, et al. Validation of an Enzyme immunoassays for analysis of Metfhoprene Reidues on Tobacco[J]. Agric. Food chem.,1992(40): 2530-2532.