梁秋波

哈藥集團(tuán)技術(shù)中心

超濾在蛋白質(zhì)純化中應(yīng)用進(jìn)展

梁秋波

哈藥集團(tuán)技術(shù)中心

超濾是一種非常實(shí)用的膜分離技術(shù)，在生物藥研發(fā)領(lǐng)域，尤其是對分泌型表達(dá)的蛋白或者抗體類進(jìn)行濃縮，配合親和層析，離子交換層析或者疏水層析等純化方法去除內(nèi)毒素等方面應(yīng)用非常廣泛。本文僅對超濾技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化和去除內(nèi)毒素方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

超濾；截留分子量；蛋白質(zhì)；濃差極化

超濾（ultrafiltration，UF）是以壓差為驅(qū)動(dòng)力的膜分離技術(shù)。即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的壓力活性膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了分離。膜分離技術(shù)從精度上劃分，一般可分為四類：微濾、超濾、納濾和反滲透，在過濾精度上一次增高。在生物制藥工程領(lǐng)域，超濾技術(shù)常用來對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化或者濃縮，或者配合各種色譜層析方法去除內(nèi)毒素等方面。

1 超濾的起源

1748年，Schmidt用棉花膠膜過濾溶液，當(dāng)給溶液施加一定壓力時(shí)，溶液透過了膜，而溶液中的懸浮物質(zhì)被截留下來，由于其過濾的精度遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于濾紙的過濾效果，可以認(rèn)為是超濾技術(shù)的最早應(yīng)用。1896年，Martin制造了世界上第一張超濾膜。隨著人類對微觀領(lǐng)域研發(fā)的逐步深入，超濾技術(shù)在二十世紀(jì)90年代以后逐步走向成熟，進(jìn)入了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用階段。

2 超濾技術(shù)在蛋白質(zhì)純化方面的應(yīng)用

在蛋白質(zhì)純化過程中，超濾技術(shù)主要有去除小分子雜質(zhì)和蛋白濃縮兩大方面的應(yīng)用。其應(yīng)用特點(diǎn)就是處理量非常大，最小處理幾升，最多可以處理幾千升，甚至上萬升，并且處理速度非?？欤?jié)省大量時(shí)間。目的蛋白被有效濃縮，使溶液體積顯著減少，目的蛋白回收率高，不僅方便了下游純化，而且由于超濾使小分子雜質(zhì)都被過濾掉，減少對純化樹脂的損傷。

徐華民[1]應(yīng)用超濾技術(shù)在提取豌豆分離蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，探討了超濾過程的壓力、溫度、膜材料和膜形式對提取效果的影響作用，采用超濾技術(shù)粗蛋白的收率達(dá)到85%-90%，效果非常好。

馬嵐，葛克山，任發(fā)政等[2]研究超濾分離酪蛋白糖巨肽的最優(yōu)工藝參數(shù)，已達(dá)到最佳超濾通量性能，研究料液pH值、操作壓力和溫度等對膜滲透通量的影響，利用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)分析超濾截留液的相對分子量分布。結(jié)果表明溶液pH值7.0、操作壓力0.3MPa、溫度45℃時(shí)膜滲透通量最高，超濾酪蛋白糖巨肽的截留率達(dá)到97.54%，產(chǎn)物純度達(dá)到92.45%，說明超濾技術(shù)是將酪蛋白糖巨肽與其他乳清蛋白分離的有效方法。

方希修，王冬梅，管軍軍等[3]應(yīng)用平板式膜超濾技術(shù)與DEAE離子交換層析法對卵黃免疫球蛋白進(jìn)行分離純化，首先將卵黃液經(jīng)過稀釋后，對其進(jìn)行超濾，并分析各種因素對其的影響，確定截留分子量為100kDa，壓力差為0.12MPa，結(jié)果截留液體回收率達(dá)到91.89%，純度為86%，最后經(jīng)過DEAE離子交換層析得到高純度的抗體。

3 超濾技術(shù)在去除內(nèi)毒素方面的應(yīng)用

內(nèi)毒素是一種脂多糖，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，內(nèi)毒素單體根據(jù)低聚糖鏈的不同，相對分子質(zhì)量為10000-20000，常常以聚體的形式存在，分子質(zhì)量可達(dá)到幾十萬至幾百萬，選擇不同截留分子量的超濾膜或者超濾離心管可以有效去除溶液中的內(nèi)毒素。

王娟，謝飛，陳潭琇等[4]在使用超濾技術(shù)去除純化后的重組融合蛋白溶液中的內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)中，采用幾種不同的離子樹脂組合去除內(nèi)毒素，結(jié)合SDS-PAGE分析蛋白純度，并使用鱟試劑檢測內(nèi)毒素的殘留，結(jié)果顯示，CM或者CM聯(lián)合疏水層析均不能有效去除內(nèi)毒素，其中疏水層析對去除內(nèi)毒素幾乎沒有效果，而CM加超濾可以有效去除內(nèi)毒素，可見超濾技術(shù)在去除內(nèi)毒素中發(fā)揮了重要作用。

張金龍，李冰，任軍等[5]在建立CHO細(xì)胞表達(dá)的抗炭疽保護(hù)性抗原人源化單抗純化工藝和質(zhì)量方法建立的試驗(yàn)中，對收貨的50L無血清懸浮培養(yǎng)的CHO工程細(xì)胞培養(yǎng)液，通過離心去除細(xì)胞及碎片后進(jìn)行超濾濃縮上清液，經(jīng)過親和層析，離子交換層析，所得的目的蛋白經(jīng)G25凝膠柱更換緩沖液后完成純化，對純化的產(chǎn)品進(jìn)行單抗鑒別、相對分子質(zhì)量、純度、生物學(xué)活性、產(chǎn)品的相關(guān)雜質(zhì)（聚集物和降價(jià)產(chǎn)物）、工藝相關(guān)雜質(zhì)（宿主蛋白殘留、蛋白A殘留）、安全性（凝膠法檢測內(nèi)毒素、薄膜過濾法考察無菌）分析，經(jīng)檢測，樣品回收率達(dá)61.7%，單抗鑒別陽性、分子質(zhì)量與預(yù)期相符，單體比例為99.25%，二聚體比例為0.75%，EC50值為0.1516μg/m l，宿主蛋白殘留，內(nèi)毒素殘留，無菌等均符合藥典要求。

綜上所述，超濾技術(shù)雖然在蛋白質(zhì)純化上有廣泛的應(yīng)用，但也有一定的局限性，如超濾膜易污染，濃差極化等問題，蛋白質(zhì)在膜上的吸附通常是污染和濃差極化的主要原因，而切向流過濾可以有效解決這一問題。隨著近些年來生物工程產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展壯大，對下游純化技術(shù)提出了更高的要求，而傳統(tǒng)的單一方法或者幾種的方法的組合往往達(dá)不到理想的效果，超濾技術(shù)由于在蛋白質(zhì)純化上的天然優(yōu)越性，其應(yīng)用一定會(huì)越來越廣泛。

[1]徐華民.超濾技術(shù)在豌豆分離蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].糧食與飼料工業(yè),1999(7)：41-42.

[2]馬嵐,葛克山,任發(fā)政等.酪蛋白糖巨肽超濾分離的工藝優(yōu)化研究[J].食品科學(xué),2008,29(12)：278-281.

[3]方希修,王冬梅,管軍軍等.超濾/DEAE離子交換層析分離純化IgY的研究[J].山東畜牧獸醫(yī),2009.

[4]王娟,謝飛,陳潭琇等.超濾技術(shù)去除重組MUC1-MBP融合蛋白中內(nèi)毒素的效果評價(jià)[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào),2014,40(3)：539-542.

[5]張金龍,李冰,任軍等.CHO細(xì)胞表達(dá)的抗炭疽保護(hù)性抗原人源化單抗的純化及質(zhì)量控制分析[J].生物技術(shù)通訊,2014,25(6)：817-820.

梁秋波（1973-），男，黑龍江北安人，哈藥集團(tuán)技術(shù)中心，碩士研究生，研究方向：重組蛋白和抗體的純化。