戰(zhàn) 英，趙一暉，陳俊竹，張培軍

吉林省疾病預(yù)防控制中心

食品毒理學(xué)與保健食品功能學(xué)評價中流式細(xì)胞術(shù)的運(yùn)用分析

戰(zhàn) 英，趙一暉，陳俊竹，張培軍

吉林省疾病預(yù)防控制中心

當(dāng)前，細(xì)胞和分子生物技術(shù)，特別是單克隆抗體與分子探針技術(shù)發(fā)展日新月異，流式細(xì)胞術(shù)日漸成熟，且在食品毒理學(xué)與保健食品功能學(xué)評價中得到了良好的應(yīng)用。該技術(shù)在快速測量細(xì)胞物理或化學(xué)性質(zhì)、分選高純度亞細(xì)胞中優(yōu)越性大，本研究即分析了流式細(xì)胞術(shù)在食品毒理學(xué)與保健食品功能學(xué)評價中的實(shí)際應(yīng)用。

食品毒理學(xué)；保健食品功能學(xué)；流式細(xì)胞術(shù)；評價

近年來，分子與細(xì)胞生物技術(shù)得到了快速的發(fā)展，促進(jìn)了單克隆抗體技術(shù)與分子探針技術(shù)的發(fā)展。其中，流式細(xì)胞術(shù)在快速測量細(xì)胞的大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)及DNA等方面具有一定的優(yōu)越性，所以在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)室檢查中得到了廣泛的應(yīng)用[1]。為了更好指導(dǎo)流式細(xì)胞術(shù)在食品毒理學(xué)與保健食品功能學(xué)評價中的應(yīng)用，本文對該命題進(jìn)行了有益的分析和探究。

一、材料與方法

本研究采用6～8周的NIH、BALB/C種雌性小白鼠與SD種雄性大鼠，均為SPF級。其中，小鼠體重16～20g，大鼠為60～90g，由第一軍醫(yī)大學(xué)提供。在開始實(shí)驗(yàn)前，將實(shí)驗(yàn)室溫度控制在22℃左右，適度為50%～75%。研究所用的儀器為FACSCalibur流式細(xì)胞儀、雙激光管及DENLEYDRAGON全自動酶標(biāo)儀，以及6孔培養(yǎng)板、細(xì)胞刮等。

根據(jù)《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗(yàn)方法》（2003版)，將小鼠進(jìn)行分組，分為高、中、低三個受試物劑量組，以及對照組，并設(shè)置左旋咪唑陽性對照組，上述三種受試樣品根據(jù)人體推薦量的5倍、10倍和30倍設(shè)計(jì)低、中、高三個等級的劑量。濃度的調(diào)配使用純凈水，給予左旋咪唑陽性對照組與陰性對照組小鼠等量的純凈水灌胃，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3d，對陽性對照組小鼠行25mg/kg左旋咪唑灌胃，持續(xù)3d，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每只小鼠腹腹腔注射2ml濃度為2%的綿羊紅細(xì)胞[2]。

大鼠的實(shí)驗(yàn)操作位，首先將大鼠分為兩個受試物劑量組、陰性對照組，根據(jù)每100g攝入量10g計(jì)算，并將三種樣品摻于飼料中，配置成0.75%、1.5%兩種不同的顆粒飼料，供給兩個劑量組小鼠，而陰性對照組給予正常飼料喂養(yǎng)，共30d。在實(shí)驗(yàn)期間，應(yīng)確保各個小組內(nèi)的小鼠飲水和飼料充足。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過對小鼠T淋巴細(xì)胞功能的檢測，發(fā)現(xiàn)模型動物、參茸膏研究中，三個劑量組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD+69/CD+3比值低、中劑量組的轉(zhuǎn)化增值能力、中劑量組遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力，均有了明顯的提高，且與陰性對照組比較，差異較為明顯（P＜0.05）。且陰性與陽性對照組的檢測結(jié)果，與傳統(tǒng)檢測指標(biāo)一致性高，提示小鼠的免疫能力高于傳統(tǒng)指標(biāo)。

NK細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，各劑量組小鼠外周血NK細(xì)胞比值、脾NK細(xì)胞活性均明顯升高，且與陰性對照組相比，差異顯著（P＜0.05）。同時，研究結(jié)果還顯示，靈芝蟲草菌絲給予大鼠后，大鼠外周血NK細(xì)胞的陽性細(xì)胞比例明顯升高，與對照組相比，具有明顯的差異（P＜0.05）。

單核/巨噬細(xì)胞檢測檢測結(jié)果顯示，靈芝蟲草菌絲三個劑量組，與陰性對照組相比，均呈現(xiàn)出總吞噬比例明顯升高、一個熒光微球巨噬細(xì)胞比例的明顯增加，且中劑量組吞噬細(xì)胞兩個熒光微球巨噬細(xì)胞的增加比例，與對照組相比具有明顯的差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、討論

在當(dāng)前的生命科學(xué)領(lǐng)域研究中，F(xiàn)CM技術(shù)的應(yīng)用范圍廣泛，屬于快速分離鑒定免疫細(xì)胞的新技術(shù)之一，在檢測單核/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及B細(xì)胞及其比率上，具有很大的優(yōu)越性，而且還能夠檢測細(xì)胞因素表達(dá)水平的高低及淋巴細(xì)胞的凋亡。而CD69分子為活化誘導(dǎo)分子之一，于靜息NK細(xì)胞與T細(xì)胞上無表達(dá)，但是活化T細(xì)胞與NK細(xì)胞表面的表達(dá)非常豐富，可作為兩種細(xì)胞表面標(biāo)記，同時也能反映細(xì)胞活化狀態(tài)[3]。

在本研究中，對小鼠、大鼠T淋巴細(xì)胞活化指標(biāo)檢測方法流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了探討，應(yīng)用于多個食品毒理學(xué)與保健食品功能學(xué)評價中的應(yīng)用，增強(qiáng)了評價的效果。但是，在食品毒理學(xué)與保健食品功能學(xué)評價中，F(xiàn)CM技術(shù)雖然有著良好的應(yīng)用，但是作為一種新近發(fā)現(xiàn)的分析技術(shù)，與其他細(xì)胞生物技術(shù)相同，不可能是萬能的，在實(shí)際的應(yīng)用中也有不少的缺陷，比如缺少直接控制及無法提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)。因此，在將其應(yīng)用于研究之前，還需要對試驗(yàn)方法做進(jìn)一步的推敲，并比較實(shí)驗(yàn)的敏感性、特異性等。一個成功的FCM技術(shù)，與正確的資料、標(biāo)志物的選擇、合適的探針及合適的儀器等明密切相關(guān)，如果不加強(qiáng)控制，則可能會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差，因此在實(shí)驗(yàn)中控制方法很關(guān)鍵[4]。同時，在可溶性蛋白檢測分析中，免疫調(diào)節(jié)過程為研究熱點(diǎn)，比如酶聯(lián)免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)等均為常用的蛋白分析方法，但是這些技術(shù)也不免存在缺陷和問題，在實(shí)際的應(yīng)用中應(yīng)明確問題，比如酶聯(lián)免疫反應(yīng)僅僅能1次反應(yīng)檢測單項(xiàng)指標(biāo)。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)屬于一種新的分析技術(shù)，在食品毒理學(xué)與保健食品功能學(xué)評價中得到了廣泛的應(yīng)用，且應(yīng)用的效果良好。但是在應(yīng)用的過程中，也不能忽視技術(shù)的缺陷和局限性，嚴(yán)格控制探針、資料和儀器設(shè)備等，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，不出現(xiàn)大的誤差。

[1]楊杏芬,黃瓊,楊明杰等.食品毒理學(xué)和保健食品功能學(xué)評價中流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用[J].毒理學(xué)雜志,2013,19(03)：322-322.

[2]黃瓊,李志,楊杏芬等.流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2007,21(02)：140-146.

[3]楊杏芬,黃瓊,黃俊明等.流式細(xì)胞術(shù)在保健食品功能評價中的應(yīng)用[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,39(05)：335-341.

[4]黃瓊,李志,楊杏芬等.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究大蒜粉對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué),2009,32(03)：19-22.

戰(zhàn)英（1976-），女，漢族，吉林長春，副教授，本科，研究方向：理化檢驗(yàn)。