劉玠　初李佳娃　張迪　曲海影　常越

[摘要] 目的 優(yōu)選七類新藥抗宮炎凝膠劑的提取工藝。 方法 采用紫外可見分光光度法分別測定廣東紫珠中的總黃酮、益母草中的鹽酸水蘇堿含量；采用高效液相色譜法對烏藥中烏藥醚內(nèi)酯的含量進行測定。分別以總黃酮、鹽酸水蘇堿、烏藥醚內(nèi)酯的含量及干膏得率為考察指標(biāo)，對處方中三味藥進行提取工藝優(yōu)化。利用正交試驗設(shè)計法，以提取次數(shù)、提取時間、溶媒量、乙醇濃度為4個因素，每個因素設(shè)計3個水平。 結(jié)果 廣東紫珠的最佳提取工藝為10倍量50%乙醇回流提取3次，每次3 h；益母草的最佳提取工藝為10倍量95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h；烏藥的最佳提取工藝為8倍量85%乙醇回流提取2次，每次1 h。 結(jié)論 優(yōu)選的提取工藝科學(xué)合理，適于提取工藝中多因素的優(yōu)選，可作為新藥抗宮炎凝膠劑的工業(yè)化生產(chǎn)提取工藝，為制備安全穩(wěn)定、速釋高效新劑型的研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 抗宮炎凝膠；提取工藝；正交試驗方法；廣東紫珠；益母草；烏藥

[中圖分類號] R461 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（b）-0060-06

慢性宮頸炎是婦科最常見的疾病之一，也是大多數(shù)育齡期婦女的常見病，其發(fā)病率高，占婦科門診總數(shù)的40%～60%，是由急性宮頸炎未治療或治療不當(dāng)或非特異性化膿性細菌等病原體長期潛伏于子宮頸黏膜所致，多見于分娩、流產(chǎn)或?qū)m頸術(shù)后，是引起盆腔臟器或身體其他器官炎癥的潛在病灶。由于病灶部位特殊，臨床以局部治療為主，治療方法有物理療法、手術(shù)療法和藥物療法，其中藥物療法因?qū)俜莿?chuàng)傷性治療，操作簡單方便，對患者要求較低而應(yīng)用廣泛。陰道給藥是指藥物經(jīng)陰道黏膜吸收發(fā)揮局部或全身作用，避免了肝臟首過效應(yīng)和胃腸道生理關(guān)卡效應(yīng)，使病灶部位的有效濃度提高，減小藥物不良反應(yīng)，提高生物利用度，增強藥物療效。

本課題研究的新藥抗宮炎凝膠劑，原劑型為抗宮炎片，收載于《中國藥典》2010年版一部中，由廣東紫珠干浸膏、益母草干浸膏、烏藥干浸膏組成，具有清濕熱、止帶下之功效，臨床用于治療因慢性宮頸炎引起的濕熱下注、赤白帶下、宮頸糜爛、出血等癥效果良好[1]。隨著宮頸疾病患病率的不斷增高與病灶部位的特殊性，陰道給藥制劑成為廣大醫(yī)務(wù)工作者的研究熱點。除傳統(tǒng)的洗劑、片劑、膜劑、膏劑等外，相繼出現(xiàn)了例如泡騰片、栓劑、凝膠劑等療效更好、使用更方便的劑型。凝膠劑與片劑、栓劑相比較患者使用無異物感，順應(yīng)性強，是陰道給藥治療宮頸糜爛的一種理想劑型?？箤m炎凝膠劑相比原抗宮炎片，避免了肝臟首過作用和胃腸道生理關(guān)卡效應(yīng)。凝膠基質(zhì)可與黏膜產(chǎn)生良好的生物相容性，增強黏附性，使病灶部位的有效濃度增加，提高生物利用度，增強藥物療效，且患者使用無異物感，順應(yīng)性強[2-4]。既改變制劑的劑型又改變給藥途徑，屬新藥研究的范疇，按現(xiàn)行《藥品注冊管理辦法》的七類新藥進行研究。因此課題對提取工藝、成型工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及穩(wěn)定性等進行實驗研究，確保新藥研發(fā)的創(chuàng)新性、可行性[5]。以成型性、細膩性、涂展性、穩(wěn)定性和溶出度為指標(biāo)進行凝膠基質(zhì)篩選；進行方中益母草、烏藥、廣東紫珠定性鑒別和金石蠶苷高效液相色譜含量測定，制訂產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；考察本制劑的影響因素試驗、長期及加速穩(wěn)定性。相比片劑，凝膠劑對藥材提取物干浸膏的要求更高，本實驗主要對制劑的提取工藝進行優(yōu)選，選用正交設(shè)計法。參照《中國藥典》2010版一部抗宮炎片項下，分別提取制得廣東紫珠干浸膏、益母草干浸膏、烏藥干浸膏。通過單因素考察，影響三味藥材制得干浸膏的因素一致，本研究依次介紹處方中藥味的提取工藝，作為參考。優(yōu)選醇提工藝條件，為確定該制劑的生產(chǎn)工藝提供實驗依據(jù)[6-10]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紫外可見分光光度儀（島津UV-1601PC）、蘆丁對照品（批號：100080-200707）、鹽酸水蘇堿對照品（批號：110712-201111）、烏藥醚內(nèi)酯對照品（批號：111568-200603）均購自中國藥品生物制品檢定所。廣東紫珠（江西萍鄉(xiāng)的廣東紫珠規(guī)范化種植研究試驗基地）、益母草和烏藥藥材（哈爾濱世一堂飲片廠）；試劑均為分析純。

1.2 廣東紫珠的提取工藝優(yōu)化

該凝膠劑中，廣東紫珠為君藥，其總黃酮是具有抗炎鎮(zhèn)痛功能的有效成分， 研究表明其醇提物對小鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[11-12]。黃酮類成分一般易溶于水、甲醇、乙醇等溶劑。采用紫外分光光度法測定總黃酮含量和出膏率作為廣東紫珠的考察指標(biāo)。

1.2.1 測定波長的確定

分別取按下述項制得的對照品溶液、供試品溶液各5 mL，置25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，放置15 min后加水至刻度，搖勻，照紫外分光光度法，于200～800 nm進行波長掃描。結(jié)果測得兩種溶液在510 nm處均有較大吸收峰，故選擇測定波長為510 nm。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取于120℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.11 mg，置于10 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液2 mL，置溫水中加熱使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

稱取廣東紫珠飲片50 g，按各實驗設(shè)計項下安排提取，提取液濾過，濾液濃縮至200 mL，即得供試品溶液。

1.2.4 總黃酮的測定方法

采用紫外分光光度法測定總黃酮，分別取蘆丁對照品溶液及供試品溶液按“1.2.1”項下方法顯色，在510 nm處測定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總黃酮含量。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取“1.2.2”項下對照品溶液0.2、0.8、1.5、2.0、2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，放置6 min，再加氫氧化鈉試液10 mL，放置15 min，加水至刻度，搖勻，測定吸收度。以相應(yīng)的溶液為空白對照。照紫外分光光度法，在510 nm處測定吸收度，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。endprint

1.2.6 正交試驗設(shè)計

以濃度為50%、60%、70%的乙醇溶液為溶劑進行提取。以總黃酮含量和出膏率為指標(biāo)，對乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)、溶劑量4個因素進行考察，各取3個水平，選用L9（3）4正交設(shè)計表。見表1。

1.2.7工藝驗證

按優(yōu)選工藝進行驗證試驗（n=3），測得平均干膏得率并對總黃酮的含量進行測定。

1.3益母草及烏藥的提取工藝優(yōu)化

益母草總生物堿具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，易溶于水和乙醇中，其中鹽酸水蘇堿含量高，易于測定，故以紫外分光光度法測定的鹽酸水蘇堿含量和出膏率作為益母草的考察指標(biāo)[13-17]。烏藥的醇提物具有較強的鎮(zhèn)痛抗感染作用，以烏藥醚內(nèi)酯為代表，易溶于乙醇中，故以高效液相色譜法測定的烏藥醚內(nèi)酯含量和出膏率作為烏藥的考察指標(biāo)。

1.3.1 鹽酸水蘇堿的含量測定

1.3.1.1 含量測定 照紫外分光光度法，確定測定波長為520 nm；用0.1 mol/L鹽酸溶液為溶劑，制備對照品溶液與供試品溶液；分別精密量取對照品溶液、0.1 mol/L鹽酸溶液及供試品溶液各10 mL置25 mL容量瓶中，分別精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，搖勻，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，置冰浴中放置1 h，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以0.1 mol/L鹽酸溶液為空白，照分光光度法，在520 nm的波長處分別測定吸收度，用空白試劑的吸收度分別減去對照品與供試品的吸收度，計算，即得。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置10 mL燒杯中，加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL，加活性碳0.5 g，置沸水浴加熱攪拌半分鐘，濾至10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液分次洗滌燒杯和濾器，洗液并入同一量瓶中；另取0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL置10 mL量瓶中。各精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，搖勻，并用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，搖勻，置冰浴中放置1 h，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以0.1 mol/L鹽酸溶液為空白，照分光光度法，在520 nm處測定吸收度，以吸收度的差值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 烏藥醚內(nèi)酯的含量測定

照高效液相色譜法測定。

1.3.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（56∶44）為流動相；檢測波長為235 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；理論塔板數(shù)按烏藥醚內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于2000。

1.3.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的烏藥醚內(nèi)酯對照品10.15 mg，置于25 mL容量瓶中，加入色譜甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（濃度為0.406 mg/mL）。

1.3.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取烏藥50 g，按各實驗設(shè)計項下安排提取，提取液過濾，濾液濃縮至200 mL。取其中10 mL蒸干，加乙醚20 mL超聲處理10 min，揮干，殘渣加色譜甲醇溶液溶解定容至10 mL，搖勻，過濾，取續(xù)濾液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。

1.3.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取上述對照品溶液2.5、3.75、5、6.25、7.5 mL，分別置10 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。分別精密吸取各對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 正交試驗設(shè)計

通過單因素實驗考察，選擇濃度為85%、90%、95%的乙醇溶液為提取溶劑，以乙醇濃度、提取時間、溶劑量、提取次數(shù)4個因素對益母草的提取工藝進行正交試驗；以濃度為75%、85%、95%的乙醇溶液為提取溶劑，對乙醇濃度、溶劑量、提取次數(shù)、提取時間4個因素對烏藥的提取工藝進行正交試驗。選用L9（3）4正交設(shè)計表。見表2、3。

1.3.4 工藝驗證

分別對益母草、烏藥按優(yōu)選工藝進行驗證試驗（n=3），測得平均干膏得率并對含量進行測定。

2 結(jié)果

2.1 廣東紫珠提取工藝優(yōu)化

2.1.1 總黃酮含量測定

蘆丁對照品濃度在8.088～101.1 μg/mL范圍內(nèi)藥物濃度與吸收度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：y = 0.0112x+0.0025（r = 0.9999，n=5）。

2.1.2正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果顯示：各因素對總黃酮含量的影響大小順序為：C（提取次數(shù)）>B（提取時間）>A（乙醇濃度）>D（加醇量）；各因素三水平之間的趨勢為A1>A2>A3，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D2>D3>D1。直觀分析得提取工藝為A1B3C3D2，即醇濃度為50%，加醇量為10倍量，回流提取3次，每次3 h。各因素對出膏率的影響大小順序為：C（提取次數(shù)）>B（提取時間）>D（加醇量）>A（乙醇濃度）；各因素三水平之間的趨勢為A1>A2>A3，B3>B2>B1，C3=C2>C1，D2>D1>D3。直觀分析得提取工藝為A1B3C3D2，即醇濃度為50%，加醇量為10倍量，回流提取3次，每次3 h。見表4。

2.1.3 方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果表明：因素B、C對總黃酮含量有顯著影響，因素A、D對總黃酮含量影響較?。灰蛩谻對出膏率有顯著影響，其他因素對出膏率影響較小。經(jīng)多方面考察，以A1B3C3D2組合最佳，即最佳提取工藝為：用50%的乙醇10倍量，回流提取3次，每次3 h。見表5。

2.1.4 廣東紫珠提取工藝驗證endprint

廣東紫珠提取工藝驗證結(jié)果見表6。廣東紫珠總黃酮含量約為6.23%（n=3），出膏率約為2.49%（n=3）。驗證試驗結(jié)果與預(yù)測值接近，說明該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 益母草及烏藥的提取工藝優(yōu)化

2.2.1 鹽酸水蘇堿含量測定

鹽酸水蘇堿對照品濃度在0.05～0.25 mg/mL范圍內(nèi)藥物濃度與吸收度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：y = 0.502x+0.0341（r = 0.9997，n=5）。

2.2.2 烏藥醚內(nèi)酯的含量測定

烏藥醚內(nèi)酯對照品濃度在0.1015～0.3045 mg/mL范圍內(nèi)藥物濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。回歸方程：y = 7 770 602.956x+52 654（r = 0.9991，n=5）。

2.2.3 益母草提取工藝優(yōu)化

正交試驗結(jié)果顯示：各因素對鹽酸水蘇堿含量的影響大小順序為：D（提取次數(shù)）>A（乙醇濃度）>B（提取時間）>C（加醇量）；各因素三水平之間的趨勢為A3>A2>A1，B1>B3>B2，C2>C1>C3，D2>D3>D1。直觀分析得提取工藝為A3B1C2D2，即乙醇濃度為95%，加醇量為10倍量，提取2次，每次1.5 h。各因素對出膏率的影響大小順序為：A（乙醇濃度）>D（提取次數(shù)）>B（提取時間）>C（加醇量）；各因素三水平之間的趨勢為A1>A2>A3，B3>B1>B2，C2>C1>C3，D3>D2>D1。直觀分析得提取工藝為A1B3C2D3，即乙醇濃度為85%，加醇為10倍量，提取3次，每次2.5 h。見表7。

方差分析結(jié)果表明：各因素對益母草中的鹽酸水蘇堿含量均無顯著差異；因素A、D對出膏率有顯著影響，因素B、C對出膏率影響較小。從提取率和節(jié)約能源等方面綜合考察，以A3B1C2D2組合最佳，即最佳提取工藝為：10倍量95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h。見表8。

2.2.4 烏藥提取工藝優(yōu)化

由烏藥提取正交結(jié)果可知：各因素對烏藥醚內(nèi)酯含量的影響大小順序為：B（加醇量）>A（乙醇濃度）>C（提取次數(shù)）>D（提取時間）；各因素三水平之間的趨勢為A2>A1>A3，B1>B2>B3，C2>C3>C1，D1>D2>D3。直觀分析得提取工藝為A2B1C2D1，即乙醇濃度為85%，加醇為8倍量，提取2次，每次1 h。各因素對出膏率的影響大小順序為：A（乙醇濃度）>B（加醇量）>C（提取次數(shù)）>D（提取時間）；各因素三水平之間的趨勢為A2>A1>A3，B2>B1>B3，C2>C3>C1，D2>D1>D3。直觀分析得提取工藝為A2B2C2D2，即乙醇濃度為85%，加醇為10倍量，提取2次，每次1.5 h。見表9。

方差分析結(jié)果表明：各因素對烏藥醚內(nèi)酯含量均無顯著差異；因素A對出膏率有顯著影響，因素B、C、D對出膏率影響較小。從提取率和節(jié)約能源等方面綜合考察，以A2B1C2D1組合最佳，即最佳提取工藝為：8倍量85%乙醇回流提取2次，每次1 h。見表10。

2.2.5 益母草及烏藥的提取工藝驗證

益母草及烏藥的提取工藝結(jié)果見表11、12。鹽酸水蘇堿含量約為0.9955%（n=3），出膏率約為6.65%（n=3）；烏藥醚內(nèi)酯含量約為40.912 mg（n=3），出膏率約為5.06%（n=3）。驗證試驗結(jié)果與預(yù)測值接近，說明優(yōu)選提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 研究意義

由于陰道可容納的藥量較小，因此在保證療效的基礎(chǔ)上，選用出膏率較少的溶劑更有利于達到對藥材高度濃縮的目的，有利于后面工作的進一步深入。本實驗對于提取溶劑的選擇，通過單因素實驗考察，均選擇出膏率較低的乙醇。

3.2 正交試驗結(jié)果的篩選

本實驗中廣東紫珠以紫外分光光度法測定總黃酮含量和出膏率為考察指標(biāo)；益母草采用紫外分光光度法測定鹽酸水蘇堿含量和出膏率為考察指標(biāo)；烏藥采用高效液相色譜法測定烏藥醚內(nèi)酯含量和出膏率為考察指標(biāo)。有效成分含量的高低是評價藥物療效的重要因素，考察方中三味藥材的有效成分并針對性地進行提取研究。干膏得率也是制劑工藝可行性的重要影響因素，能體現(xiàn)中藥制劑的提取情況，是經(jīng)典的考察指標(biāo)之一。通過正交試驗，優(yōu)選出三種原料藥的最佳提取工藝。

3.3 研究機制分析

通過查閱資料，廣東紫珠主要成分為黃酮類化合物，它具有較好的抗菌消炎作用，其外用治療跌打腫痛、外傷出血、燒傷等癥；益母草主要含有益母草堿、水蘇堿等成分，具有活血調(diào)經(jīng)、清熱解毒之功效[18-19]，由益母草、柴胡、丹皮等中藥制成的外用貼劑，治療盆腔炎效果顯著；烏藥具有抗病毒、抑菌、抗感染鎮(zhèn)痛等藥理作用，其外用可使局部血管擴張，緩和肌肉痙攣性疼痛[20-23]。綜上所述，三味藥外用均具有消炎鎮(zhèn)痛的作用。通過對原藥材鑒定、提取工藝、成型工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性的研究，所研制的抗宮炎凝膠劑性質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)量可控、使用方便。本研究不僅符合“三小”、“三效”、“五便”的用藥原則，同時為凝膠制劑的研究提供重要的參考依據(jù)，也為治療婦科疾病臨床用藥的劑型發(fā)展開辟了道路。

3.4 研究劑型分析

影響藥物陰道吸收的因素有生理因素，藥物理化性質(zhì)和劑型等因素，劑型是藥物應(yīng)用的形式，對藥效的發(fā)揮極為重要。選擇合適的劑型還可以降低或消除藥物的不良反應(yīng)，提高藥效。本課題將片劑改為凝膠劑，凝膠劑與陰道黏膜具有良好的偶合和水合作用，可較長時間與病灶部位黏附緊密，能充盈整個陰道，有較好的生物相容性，有利于藥物的釋放，能更好地發(fā)揮療效，是治療宮頸疾病較理想的劑型，為本制劑改變原給藥途徑提供了充分的理論依據(jù)[24-26]。

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（收稿日期：2014-09-10 本文編輯：衛(wèi) 軻）endprint